活血溫腎方防治肝纖維化大鼠的實(shí)驗(yàn)研究

王 秀 嚴(yán)艷欣

（安徽省皖南醫(yī)學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合研究中心，蕪湖241001）

活血溫腎方防治肝纖維化大鼠的實(shí)驗(yàn)研究

王 秀 嚴(yán)艷欣

（安徽省皖南醫(yī)學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合研究中心，蕪湖241001）

目的 探討活血溫腎方對(duì)肝纖維化大鼠的防治作用及作用機(jī)制。方法 采用四氯化碳肝纖維化大鼠模型，隨機(jī)分為五組：正常組、模型組及三個(gè)用藥組 （溫腎組、活血組、合用組），用藥組分別予以溫腎方、活血方、合用方 （溫腎方+活血方）灌胃，連續(xù)用藥4周后，ELISA法測(cè)定大鼠血清中透明質(zhì)酸 （HA）、睪酮 （T）、雌二醇 （E2），比色法測(cè)定ALT、AST、A、G、肝組織羥脯氨酸 （HYP），計(jì)算臟器指數(shù)。結(jié)果 ①各用藥組的ALT、AST，HA及肝組織HYP含量均降低，逆轉(zhuǎn)A／G倒置，溫腎組及合用組優(yōu)于活血組，尤以合用組效果最好。②各組之間T及E2含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05），各組T含量依次為：合用組＞溫腎組＞正常組＞活血組＞模型組。各組E2含量依次為：模型組＞活血組＞正常組＞溫腎組＞合用組。③溫腎組及合用組的睪丸臟器指數(shù)升高，腎臟指數(shù)在各組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。病理學(xué)顯示，各用藥組大鼠肝纖維化與模型組相比均有不同程度的改善，且以合用組最為顯著。結(jié)論 活血溫腎法具有較好的抗肝纖維化作用，可能是通過(guò)糾正性激素的紊亂而發(fā)揮作用的。從而為臨床治療肝纖維化提供了新思路、新方法和新藥物。

溫腎；活血；肝纖維化；大鼠

“肝腎相關(guān)”說(shuō)源于 “肝腎同源”理論，肝腎因精髓血的互生而密切聯(lián)系在一起，臨床據(jù)此通過(guò)從肝論治腎病，從腎論治肝病的實(shí)踐，而有了 “肝腎相關(guān)”說(shuō)，用于指導(dǎo)臨床，取效甚宏。胡劍北教授通過(guò)對(duì) “肝腎相關(guān)”的文獻(xiàn)、理論與臨床研究認(rèn)為其中的“肝”實(shí)體為人體肝臟［1］，“腎”實(shí)體包括人體生殖性腺和腎上腺［2］?，F(xiàn)代研究也表明人體慢性肝病時(shí)存在明顯的性激素環(huán)境紊亂及腎上腺功能低下［3］，腎上腺皮質(zhì)激素具有良好的抗炎降解膠原纖維的作用，臨床治療慢性肝病有一定的效果，雌激素經(jīng)實(shí)驗(yàn)研究證明對(duì)肝纖維化也有一定的作用［4］，肝腎實(shí)體之間存在著密切的關(guān)系。

針對(duì)肝纖維化治療主要是以活血化瘀法為中心的多種不同治法的研究，以肝腎相關(guān)理論為指導(dǎo)，從肝腎形體角度進(jìn)行治療探討的較少。歸經(jīng)理論是建立在中醫(yī)臟腑經(jīng)絡(luò)理論基礎(chǔ)上的，形體醫(yī)理學(xué)認(rèn)為中醫(yī)理論與人體形體之間存在著密切的關(guān)系，那么歸經(jīng)也應(yīng)和形體醫(yī)理學(xué)的臟腑實(shí)體相對(duì)應(yīng)，因此我們根據(jù)五版 《中藥學(xué)》教材中記載的藥物歸經(jīng)選擇歸腎經(jīng)的溫補(bǔ)腎陽(yáng)藥物，防治發(fā)生于肝臟實(shí)體的實(shí)驗(yàn)性肝纖維化的實(shí)驗(yàn)研究，以驗(yàn)證提出的上述假設(shè)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD雄性大鼠50只，體重180±20g，購(gòu)于南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心 （合格證號(hào)：蘇SYXK2003-0053）。從第4周開(kāi)始，將四氯化碳致慢性肝損傷，大鼠隨機(jī)分成正常組、模型組、溫補(bǔ)腎陽(yáng)組 （溫腎組）、活血化瘀組 （活血組）、二方合用組 （合用組），

1.2 藥物與試劑 溫腎方：仙靈脾、仙茅、肉蓯蓉、巴戟天、蛇床子、陽(yáng)起石；活血方：雞血藤、姜黃、五靈脂、赤芍、月季花、蟅蟲(chóng)。二方均采用常規(guī)煎煮方法，100目孔篩過(guò)濾，90℃水浴濃縮至1g／ml（含生藥量），4℃冰箱冷藏備用。

主要試劑：血清肝功能試劑盒 （由上海榮盛生物技術(shù)有限公司）；羥脯氨酸 （HYP）測(cè)試盒 （南京建成生物工程研究所）；透明質(zhì)酸 （HA）、睪酮 （T）、雌二醇（E2）ELISA試劑盒 （上海海軍醫(yī)學(xué)研究所）。

1.3 大鼠慢性肝纖維化模型的制作及給藥方法 采用小劑量四氯化碳皮下注射法。于實(shí)驗(yàn)第一天起在大鼠背部皮下注射40%四氯化碳植物油溶液，0.3ML／100g，每三天一次，連續(xù)8周。從造模第4周起給藥，正常組予以等容量蒸餾水灌胃；溫腎組給予溫腎方濃縮液（6.5g／ （kg·d））灌胃，活血組給活血方濃縮液5.6g／（kg·d）灌胃，合用組給二方合用濃縮液 （溫腎方6.5+活血方5.6 g／（kg·d））灌胃。第8周末末次給藥后戊巴比妥納麻醉，腹主動(dòng)脈取血離心，制備血清。肝、腎、睪丸等臟器稱(chēng)重，計(jì)算肝指數(shù) （肝濕重／體重）、腎指數(shù) （腎濕重／體重）、睪丸指數(shù) （睪丸濕重／體重）。取右葉肝臟相同部位1克，與蒸餾水按1：9的比例置于玻璃勻漿器中充分碾磨混勻制備10%的肝組織勻漿液。

1.4 觀察指標(biāo)與方法 血清肝功能 （ALT、AST、白蛋白、球蛋白）、肝羥脯氨酸均用UV-2800型分光光度計(jì)（北京瑞利分析儀器公司）檢測(cè)；血清透明質(zhì)酸、睪酮及雌二醇應(yīng)用Anthos luey2安圖酶標(biāo)儀檢測(cè)。

1.5 組織病理學(xué)觀察 大鼠肝臟經(jīng)10%福爾馬林固定，石蠟包埋，HE染色，觀察大鼠肝臟組織學(xué)變化。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 計(jì)量資料采用表示，組間方差分析和q顯著性檢驗(yàn)，均采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。

2 結(jié)果

2.1 活血方、溫腎方及合用方對(duì)肝纖維化大鼠血清肝功能的影響 模型組血清ALT、AST較正常組顯著升高，白蛋白／球蛋白明顯倒置；各治療組與模型組比，以上幾項(xiàng)指標(biāo)均有顯著改善 （P＜0.05），各組改善程度不一，以合用組療效最佳，溫腎組次之，活血組最差。與正常組比，差異有顯著性 （P＜0.05）。（見(jiàn)表1）

表1 活血方、溫腎方及合用方對(duì)慢性肝損傷大鼠血清肝功能的影響 （x±s）

2.2 活血方、溫腎方及合用方對(duì)肝纖維化大鼠HA及肝HYP含量的影響 由表2可知，模型組較正常組以上二指標(biāo)均明顯升高，各治療組顯著降低，依次為活血組、溫腎組、合用組。

表2 活血方、溫腎方及合用方對(duì)慢性肝損傷大鼠HA及肝HYP含量的影響 （x±s）

2.3 活血方、溫腎方及合用方對(duì)肝纖維化大鼠T及E2含量的影響 由表3可知，與正常組比較，模型組與活血組睪酮顯著降低，雌二醇顯著升主高，溫腎組與合用組睪酮顯著升高，雌二醇顯著降低。

表3 活血、溫腎及合用方對(duì)慢性肝損傷大鼠血清T及E2含量的影響 （x±s）

2.4 活血方、溫腎方及合用方對(duì)肝纖維化大鼠臟器指數(shù)的影響 由表2可知，模型組肝指數(shù)明顯高于正常組，治療組肝指數(shù)顯著小于模型組，活血組、溫腎組、合用組肝指數(shù)依次減小 （P＜0.05）；腎指數(shù)在各組之間無(wú)顯著差異，睪丸指數(shù)溫腎組與合用組顯著大于模型組。

表4 活血、溫腎及合用方對(duì)慢性肝損傷大鼠肝、腎、睪丸指數(shù)的影響 （x±s，%）

2.5 溫腎方、活血方及合用方對(duì)肝纖維化大鼠肝臟病理學(xué)改變的影響 正常組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞排列整齊，無(wú)炎細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組大鼠肝組織形成了假小葉，肝索排列紊亂，小葉內(nèi)中央靜脈偏離或消失，慢性炎細(xì)胞浸潤(rùn)。活血組大鼠肝組織有不完整的假小葉，肝索排列稍紊亂，匯管區(qū)纖維組織增生，少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；溫腎組肝組織內(nèi)灶性炎細(xì)胞浸潤(rùn)，肝小葉間和中央靜脈周?chē)倭坷w維組織增生。合用組大鼠肝小葉未被完全分割，肝索排列尚規(guī)則，匯管區(qū)偶有炎癥細(xì)胞。

3 討論

由于慢性肝病的多發(fā)性與危害性，防治慢性肝病成為目前研究的熱點(diǎn)，采用的活血化瘀法、清熱利濕法等確取得了一定的療效。然而毋庸置疑，目前無(wú)論中醫(yī)還是西醫(yī)防治慢性肝病的方法均非理想，治療效果有待提高，因而尋找一種更為有效的治療方法，就顯得異常迫切。

本課題以肝腎同源理論為指導(dǎo)，從腎論治肝病，以HA、HYP為檢測(cè)指標(biāo)，探討溫腎補(bǔ)陽(yáng)藥對(duì)肝纖維化的治療作用。HA可以反映肝纖維化的發(fā)展變化，HYP（羥脯氨酸）是衡量機(jī)體膠原組織代謝的重要指標(biāo)，測(cè)量HYP濃度可以較好的反映肝組織膠原的合成情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明溫腎方藥能改善肝功能，降低血清HA、肝組織HYP的濃度，病理結(jié)構(gòu)改善，有良好的抗肝纖維化作用，且優(yōu)于活血方。

一般認(rèn)為雌激素具有抗肝纖維化作用［5］，且溫腎方組成藥物均有性激素樣作用，本研究從性激素方面對(duì)其作用機(jī)理進(jìn)行了初步探討。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明溫腎組及合用組后血清雌二醇均出現(xiàn)了下降，睪酮水平上升，而模型組及活血組出現(xiàn)雌二醇升高，睪酮降低。溫腎方中的仙靈脾、仙茅、肉蓯蓉、巴戟天、蛇床子具有雌激素樣作用［6-10］，而植物雌激素具有弱的雌激素樣作用和抗雌激素作用，對(duì)于低激素水平者可以起到雌激素樣作用，而對(duì)于高激素水平者可產(chǎn)生抗激素作用［11］。提示溫腎方抗肝纖維化作用機(jī)制可能是通過(guò)調(diào)整紊亂的性激素而發(fā)揮抗纖維化作用。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明溫腎方與活血方合用有著更顯著的抗肝纖維化作用，可能是兩方分別作用于不同的環(huán)節(jié)，活血化瘀藥可以抑制肝星狀細(xì)胞的增殖，抑制膠原纖維的增生［12-13］，溫補(bǔ)腎陽(yáng)藥則通過(guò)調(diào)節(jié)體內(nèi)性激素分泌，產(chǎn)生了協(xié)同作用，從而增加了療效；或者兩方合用，產(chǎn)生了新的化合物，以致療效增強(qiáng)，具體機(jī)制還有待進(jìn)一步探討?？傊@一結(jié)果提示溫腎方與活血方聯(lián)用可能為臨床提供新的抗肝纖維化的思路、方法和藥物。

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Ef f e c t an d Me c h anism o f Kid ne y-War min g De c o c tion on Fib r o sis o f t he Liv e r in Ra t

W ang Xiu Yan Yanxin
（Centre of Combination of TCM and West M edicineWannan M edical college'W uhu'241002'China）

Object To investigate the effect and mechanism of Kidney-Warming Decoction on CCL4-induced fibrosis of the liver in rats．Methods Using CCL4-induced fibrosis of the liver in rats，randomly divided into the normal group，the model group，kidney-warming group，promoting blood flow group and combination group．The latter three groups were intragastric administration with Kidney-Warming Decoction，Promoting Blood Flow Decoction and Combination Decoction．After 4 weeks，detected hyaluronic acid（HA），T，E2by ELISA，determined the ALT，AST，A，G，hydroxyproline（HYP）of liver tissue by colorimetric method，and calculated visceral index．Results ①The ALT，AST，HA and HYP concentration of three treatment groups were decreased，reversal of white／ball upside down．The effect of kidney-warming group and combination group were better than promoting blood flow group，the combination group was the best．②Testosterone（T）and estradiol（E2）concentration of each group had significant difference（P＜0.05）．T concentration in order：kidney-warming group＞combination group＞normal group＞promoting blood group＞model group；E2concentration in order：model group＞promoting blood group＞normal group＞combination group＞kidney-warming group．③Testis index of kidney-warming group and combination group were increased and renal index was no significantly different between groups．Pathology showed that the degree of liver fibrosis in medication group rats was lower than mode group，and combination group was the most significant．Conclusion It is suggested that Kidney-Warming Decoction had good effect on treating hepatic fibrosis，may be through adjusting sex hormones disorder．It provides new ideas，new methods and new drugs for the clinical treatment of hepatic fibrosis．

Kidney-Warming Decoction；hepatic fibrosis；hydroxyproline；sex hormone；Rats

doo：10.3969／j.issn.1672-2779.2014.08.099

1672-2779（2014）-08-0001-02

楊 杰 本文校對(duì)：

2013-01-02）