胃癌組織中THBS2基因水平與MVD、MMP-2表達(dá)的相關(guān)性

聶 娜 吳小翎 寧 波 羅紅春 劉 波 劉 倩

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院金山醫(yī)院體檢中心，重慶 401122)

胃癌的預(yù)后與胃癌的病理分期、部位、組織類型、生物學(xué)行為以及治療措施有關(guān)〔1〕。但是，癌癥的致病原因、發(fā)病機(jī)制都不是很明確，現(xiàn)在大量的學(xué)者都從基因水平研究胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲以及轉(zhuǎn)移。血小板反應(yīng)蛋白2(THBS2)基因是凝血酶敏感素家族成員之一〔2〕。本文通過檢測(cè)胃癌組織以及正常胃黏膜組織THBS2基因水平，研究THBS2基因水平與微血管密度(MVD)、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2表達(dá)的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集我院腫瘤科2012年6月至2014年2月的胃組織標(biāo)本(石蠟包埋)110例，其中胃癌標(biāo)準(zhǔn)80例，正常胃旁黏膜組織30例。胃癌組織其中男51例，女27例，年齡35～75〔平均(55±11.797)〕歲，病理分型:早期胃癌 19 例，進(jìn)展性胃癌有61例;組織分型乳頭狀腺癌18例、管狀腺癌12例、低分化腺癌39例、黏液腺癌4例、印戒細(xì)胞癌7例;根據(jù)TNM分級(jí)標(biāo)準(zhǔn):Ⅰ～Ⅱ15例，Ⅲ～Ⅳ65例;有淋巴轉(zhuǎn)移68例，無淋巴轉(zhuǎn)移12例。正常胃旁黏膜組織均取自胃癌組織半徑5 cm范圍外，男17例，女13例，年齡30～75歲〔平均(51±9.987)〕歲。

納入標(biāo)準(zhǔn):①可以收集到患者完整的檢查和治療資料。②未合并其他重要的合并癥或者并發(fā)癥，或者內(nèi)分泌性疾病，未服用可能對(duì)研究指標(biāo)有影響的藥物。③患者在切除腫瘤前均未進(jìn)行放、化療，正常的胃黏膜組織無任何的癌細(xì)胞浸潤(rùn)。④符合倫理道德，家屬或者患者簽署知情同意書等。排除標(biāo)準(zhǔn):①患有其他重要的器官衰竭性疾病，或者內(nèi)分泌性疾病。②手術(shù)前服用可能影響研究效果和結(jié)局的藥物。③在實(shí)驗(yàn)研究過程中，病人或者家屬不依從、不配合、容易產(chǎn)生失訪以及拒絕參加試驗(yàn)者。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 細(xì)胞黏附分子CD34與MMP-2來自鼠抗人單克隆抗體，均購(gòu)自上海寶曼生物科技有限公司。石蠟切片免疫組化采用EnVision二步法染色，上海芯超生物科技有限公司生產(chǎn)。Trizol總RNA抽取試劑盒，購(gòu)自北京百泰克生物技術(shù)有限公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自北京華大蛋白質(zhì)研發(fā)中心有限公司，RT-PCR試劑盒、TaKaRa RNA kit購(gòu)自大連寶生物公司。

1.3 方法

1.3.1 RNA提取以及cDNA合成 RNA提取:50～100 mg組織中加入1 ml Trizol試劑;15℃ ～30℃靜置5 min使核蛋白充分解離，加入0.2 ml(1 ml Trizol試劑)氯仿，充分劇烈振蕩15 s，15℃ ～30℃ 靜置 2 ～3 min，2℃ ～8℃ 12 000 r/min 離心15 min。加入0.5 ml異丙醇輕輕混勻，15℃ ～30℃靜置10 min后，在管底出現(xiàn)膠狀沉淀即為RNA，2℃ ～8℃ 12 000 r/min離心10 min后棄去上清，向沉淀中加入1 ml 75%乙醇，輕輕混勻，于2℃ ～8℃ 7 500 r/min離心5 min后棄上清，將RNA樣品晾干(不要徹底干燥)，加入適量DEPC水溶解(可于55℃ ～60℃促溶10 min)，最后應(yīng)用紫外分光光度儀分別測(cè)定A260和A280值以確定提取的RNA的純度。置-80℃保存待用，所有的步驟都嚴(yán)格按照Trizol總RNA抽取試劑盒操作說明進(jìn)行。嚴(yán)格按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的操作要求將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，20 μl反應(yīng)體系中包括總 RNA 2 μg，5 ×Buffer 緩沖液 4 μl，25 nmol/LdNTPmix 1 μl，Oligo(dT)151 μl，RNA 酶抑制劑 1 μl，加焦碳酸二乙酯(DEPC)水至20 μl。

1.3.2 PCR反應(yīng) 應(yīng)用primer-blast在線設(shè)計(jì)引物，正義鏈(5＇→ 3 ＇)GACGGCATCCAGTACAGAGG;反 義 鏈 (5 ＇→ 3 ＇)TTTCAGTGTTCCGGACCGAG，片段長(zhǎng)度186 bp，應(yīng)用RT-PCR試劑盒進(jìn)行多份PCR反應(yīng)，嚴(yán)格按照試劑盒的操作進(jìn)行。

1.3.3 CD34與MMP-2免疫組化染色 利用采用EnVision二步法，分別檢測(cè)胃癌組織和正常胃黏膜組織中CD34與MMP-2的表達(dá)水平，嚴(yán)格按照操作說明書進(jìn)行檢測(cè)和染色。MMP-2蛋白水平的判斷方法:均定位于胃癌細(xì)胞質(zhì)或者胞膜，陽性表達(dá)為黃色顆?；蛘咦攸S色顆粒。在光鏡下選擇具有代表性的區(qū)域計(jì)算陽性細(xì)胞數(shù)并且積分，MVD的判斷方法:采用最高血管密度計(jì)數(shù)法，一般CD34陽性染色定位在血管內(nèi)皮細(xì)胞膜或胞質(zhì)，呈棕黃色。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0軟件行t及χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 胃癌組織和胃正常黏膜組織中THBS2基因的表達(dá) 胃癌組織中THBS2基因水平為-1.2±0.05，而正常的胃黏膜組中為-1.82±0.12，兩組之間的差異顯著(P＜0.05)。

2.2 THBS2基因表達(dá)與MMP-2蛋白水平的相關(guān)性 THBS2基因高表達(dá)51例，低表達(dá)29例，在THBS2基因高表達(dá)的區(qū)域中MMP-2蛋白表達(dá)陰性6例，弱陽性15例，陽性30例;THBS2基因低表達(dá)的區(qū)域中MMP-2蛋白表達(dá)陰性5例，弱陽性10例，陽性有14例。THBS2基因高表達(dá)與低表達(dá)與MMP-2蛋白表達(dá)具有密切的關(guān)系(P＜0.05)。見表1。

表1 THBS2基因表達(dá)與MMP-2蛋白水平相關(guān)性(s)

表1 THBS2基因表達(dá)與MMP-2蛋白水平相關(guān)性(s)

組別 n THBS2基因 陰性 弱陽性 陽性 r值 P值MMP-2蛋白表達(dá)高表達(dá) 51 -1.12±0.021.20±0.11 2.89±1.25 4.35±1.370.673 0.000低表達(dá) 29 -1.53±0.040.67±0.09 2.12±1.50 3.34±1.25 0.485 0.000 t值 4.373 2.899 3.23 2.39 P值0.011 0.032 0.021 0.045

2.3 THBS2基因表達(dá)與MVD的相關(guān)性 胃癌組織中MVD為45.34±12.35，與 THBS2 基因表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0.432，P=0.001)。

3 討論

THBS2基因是凝血酶敏感素家族成員之一，屬于多功能細(xì)胞間糖蛋白，含有多種結(jié)合位點(diǎn)，主要有凝血酶、纖維蛋白原以及肝素等。大量的文獻(xiàn)資料表明THBS2基因在大多數(shù)腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用，尤其是在胃癌組織中異常表達(dá)〔2〕。THBS2基因主要在腫瘤組織中微血管的產(chǎn)生中起調(diào)節(jié)作用，是必不可少的因素〔3，4〕。

本文結(jié)果顯示，THBS2基因在胃癌組織中微血管的形成中發(fā)揮重要的作用，THBS2基因與MVD與MMP-2表達(dá)呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系，說明MVD與MMP-2表達(dá)水平隨著THBS2基因的表達(dá)水平升高而升高，THBS2基因變化可能是通過促進(jìn) MVD、MMP-2表達(dá)實(shí)現(xiàn)的〔5，6〕，但是這種作用還要進(jìn)一步研究。

1 熊元?jiǎng)?，劉金?36例青年人胃癌治療體會(huì)〔J〕.遼寧醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2013;34(1):70-1.

2 力 超，林賢東，蔡曉雯，等.凝血酶敏感素-2在胃癌中的表達(dá)及其臨床意義〔J〕.中國(guó)腫瘤臨床，2013;40(20):1227-31.

3 席 妍，王彥榮，馮立艷，等.非小細(xì)胞肺癌組織MMP-2表達(dá)及MVD 的研究〔J〕.中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2010;14(12):1960-2.

4 李平棟，于振坤，黃志剛，等.喉癌MMP-2和TIMP-2表達(dá)與瘤內(nèi)微血管密度的相關(guān)性〔J〕.中國(guó)耳鼻咽喉頭頸外科，2007;14(9):514-8.

5 王 軍，羅 兵.基質(zhì)金屬蛋白酶及其抑制物與腫瘤相關(guān)性研究進(jìn)展〔J〕.實(shí)用醫(yī)藥雜志，2006;23(2):218-21.

6 Reis PP，Waldron L，Perez-Ordonez B，et al.A gene signature in histologically normal surgical margins is predictive of oral carcinoma recurrence〔J〕.BMC Cancer，2011;11:437.