IGFBP3表達在急性髓系白血病中的意義

劉琳，廖子龍，徐贏東，魏鑫，王曉鷗，樊華

（中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院血液內(nèi)科，沈陽 110001）

急性髓系白血?。╝cute myeloid leukemia，AML）是造血干細胞在增殖分化過程中發(fā)生增殖失控、分化成熟障礙、凋亡受阻大量蓄積于造血器官引起的惡性克隆性疾病，發(fā)病受多種因素的影響［1］。胰島素樣生長因子結合蛋白 3（insulin＆x100ccf;like growth factorbinding protein 3，IGFBP3）是胰島素樣生長因子信號通路中的一員，基因定位于7p12＆x100ccf;14，含有5個外顯子，mRNA長2.4 kb，表達的蛋白由264個氨基酸殘基（含18個半胱氨酸）組成，分子量為29 kd［2］。IGFBP3蛋白在血清中一方面可以與胰島素樣生長因子（insulin＆x100ccf;like growth factors，IGFs）結合，抑制IGFs與胰島素樣生長因子結合蛋白受體（insulin＆x100ccf;like growth factors＆x100ccf;R，IGF＆x100ccf;R）的結合，抑制IGF＆x100ccf;R激活后所具有的促進細胞增殖、轉移和抗凋亡作用；另一方面也可以不依賴IGF直接與細胞中的受體（如維生素D受體、RXRα受體、TGF＆x100ccf;β受體等）結合，調控細胞的生長、代謝、分化、增殖［3］。近年來，越來越多的研究集中在IGFBP3對腫瘤細胞的影響上。這些研究以實體瘤為主，它的表達及作用可能因腫瘤的種類、特點、微環(huán)境的不同而不同［4，5］，而對IGFBP3在惡性血液病中的作用研究存在不足，也有一些文獻提到在急性淋巴細胞白血病中血清蛋白水平減低［6］，甚至一些人將IGFBP3血清蛋白水平作為評估預后的指標。但是關于其在AML中，表達和作用尚不清楚。本研究試圖在AML患者血清中檢測IGFBP3蛋白水平，評估其臨床相關性，為探討AML的發(fā)病機制和治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 研究對象

收集2013年3月至2014年1月在我院血液科門診、住院確診的32例初治AML患者的血清標本，根據(jù)FAB分型標準，M1 1例、M2 10例、M3 4例、M4 1例、M5 15例、未分化白血病1例；完全緩解（complete remission，CR）組 22例；對照組 14例，為骨髓象正常的非惡性血液病患者，其中糖尿病患者4例、腎功能不全3例、正常供者5例，免疫性血小板減少患者2例。均取得了患者的知情同意。

1.2 材料

IGFBP3 ELISA試劑盒購自上海拜力生物科技有限公司，紫外分光光度計（450 nm）UV765由上海精密儀器儀表有限公司購得，離心機TG16W由上海領成生物科技有限公司提供。

1.3 實驗方法

1.3.1 提取外周血血清：在患者清晨空腹狀態(tài)下采用黃色促凝管抽取外周血4～6 mL，隨后將新鮮標本放于離心機中，3 000 r/min轉速下離心10 min，吸取1 mL淡黃色上清留置于1.5 mL無菌EP管中，放入-80冰箱凍存。

1.3.2 ELISA法測定IGFBP3血清蛋白水平：68例樣品使用前完全解凍，取出96孔板，向其中5個孔槽中加入不同濃度標準品各50 μL，隨后向其余孔槽加入68例樣品各10 μL，再加入稀釋液40 μL，余下孔槽做空白對照，再向各個孔槽加入IGFBP3抗體100 μL，37避光孵育1 h，取出孔板，向各個孔槽加入A、B底物各50 μL，再次37避光孵育1 h，隨后加入終止液50 μL。450 nm紫外分光光度計測定各個樣品及標準品的吸光度（OD值）并得到標準品的濃度梯度方程（圖1），再將吸光度代入方程中計算實際濃度，每個樣品重復測定3次。

圖1 IGFBP3蛋白的濃度梯度曲線Fig.1 Concentration gradient curve equation of IGFBP3 protein

1.4 統(tǒng)計學方法

應用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，3組的ELISA結果的濃度值均用±s表示，采用單因素方差分析比較組間差異，獨立樣本t檢驗比較均值；P＆lt;0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 ELISA結果

ELISA法測定68例外周血血清中IGFBP3蛋白水平，并比較3組蛋白水平的差異，結果見表1、圖2。

表1 急性髓系白血病患者IGFBP3蛋白水平（±s）Tab.1 Serum IGFBP3 protein expression levels in AML patients（±s）

表1 急性髓系白血病患者IGFBP3蛋白水平（±s）Tab.1 Serum IGFBP3 protein expression levels in AML patients（±s）

1）P＆gt;0.05 compare to normal；2）P＆lt;0.05 compare to normal.

Group n Protein level（μg/mL）P Normal 14 0.877 5±0.603 0 CR 22 0.862 5±0.399 8 0.881）De novo AML 32 0.533 7±0.255 0 0.0012）

圖2 急性髓系白血病患者蛋白水平Fig.2 Serum IGFBP3 protein levels in AML patients

2.2 初治AML患者IGFBP3血清蛋白水平與臨床特征的關系

SPSS 17.0統(tǒng)計分析軟件分析不同年齡（≥60歲、＆lt;60歲）、性別（男、女）、FAB分型（M2、M3、M5）之間的相關性，見表2，未發(fā)現(xiàn)上述各種臨床因素與IGFBP3血清蛋白水平有明顯相關性。

3 討論

AML是一組造血干細胞惡性克隆性疾病，占成人急性白血病的70%以上，總體預后差，3年無病生存僅30%。發(fā)病機制不明。越來越多的研究表明，細胞遺傳學和分子遺傳學異常與AML的發(fā)生發(fā)展密切相關，可以作為診斷、預后評估以及個體化治療的分子標志［7］。

IGFBP3含有3個結構域，N末端、C末端、中間可變結構域，通過N末端的富含半胱氨酸的GCGC＆x100ccf;CXXC保守序列識別IGFs，通過含有6個半胱氨酸的C末端結合IGFs，形成U形結構，競爭性抑制IGFs與IGF＆x100ccf;R結合，進而抑制IGF＆x100ccf;R信號傳導，抑制下游的絲裂原激活蛋白激酶（mitogen＆x100ccf;activatedprotein kinase，MAPK）途徑和磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3＆x100ccf;kinase，P13K）途徑激活［8］，抑制腫瘤增殖。在對K562細胞株的研究中發(fā)現(xiàn)c＆x100ccf;myc基因通過抑制IGFBP3的表達促進細胞增殖［9］。在HL＆x100ccf;60、U937細胞株研究中發(fā)現(xiàn)IGFBP3可以與維甲酸受體（RAR receptor/RXR receptor，RAR/RXR）作用抗白血病細胞增殖［10］。所以我們可以推測，IGFBP3可能在AML的發(fā)病中起一定作用。同時，越來越多的研究表明，AML的發(fā)生與范可尼通路（Fanconi pathway，F(xiàn)A pathway）異常有關，如FANCG、BRCA1等在白血病細胞中的異常表達均提示可能促進白血病的發(fā)生［11，12］。2012年的一項研究發(fā)現(xiàn)范可尼貧血腫瘤相關通路的基因集富集分析中發(fā)現(xiàn)核心富集基因IGFBP、纖維母細胞生長因子受體（fibroblast growth factor receptor，F(xiàn)GFR）、D4S23E等與腫瘤形成及耐藥相關，進一步提示了它的表達異?？赡芘c白血病的發(fā)生有關［13］。

表2 急性髓系白血病患者IG FBP3蛋白與臨床特征相關性Tab.2 Relations between IGFBP3 protein levels and the clinical features in de novo AML patients

基于上述文獻報道，為了推測IGFBP3是否與成人AML的發(fā)生有關，我們檢測AML患者血清的IGFBP3蛋白水平。

本研究我們發(fā)現(xiàn)，初治組血清IGFBP3蛋白水平減低，CR組和對照組均明顯高于初治組。由此我們推測IGFBP3可能作為一種具有抑癌作用的蛋白在AML的發(fā)病中起到一定作用，它在血清中水平下降也有可能參與AML的發(fā)生。CR患者中，該蛋白水平與對照組無顯著性差異。我們推測，IGFBP3還可以作為一種反映療效的指標判斷AML的治療效果。

雖然已經(jīng)證實了IGFBP3有抑癌作用，但是對于IGFBP3減低的機制還有待研究。近來的一項研究發(fā)現(xiàn)IGFBP3同其他通路的相互作用參與了細胞的凋亡、自噬、DNA修復過程［14］，由此我們可以看出，IGFBP3蛋白可能與其他通路相互作用，影響血清IGFBP3蛋白的含量。還有一些文章提到，IGFBP3蛋白的減低還可能與腫瘤細胞中其基因表達減低有關，如一項胃癌的研究提到IGFBP3在實體瘤細胞中表達減低可能與它的啟動子區(qū)域＆x100ccf;202位點CPG島異常甲基化狀態(tài)有關［15，16］，一項針對結腸腫瘤的Meta分析提到IGFBP3的表達減低與＆x100ccf;202位點與甘氨酸32丙氨酸的突變有關，在前列腺癌的研究中，這些突變還影響血清中IGFBP3蛋白水平，但是這些表達減低的機制還不明確。所以，加深IGFBP3基因水平及其影響因素的研究尤為重要，這也是我們今后研究的方向。

綜上所述，IGFBP3作為胰島素樣生長因子信號通路中的一員，越來越引起人們的關注。對AML的發(fā)病具有一定的作用。所以，進一步加深此基因在AML的表達調控機制的研究，不僅可以使AML發(fā)病機制的研究更為全面，還可以為治療提供新的靶點。

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