RhoA蛋白在人非小細胞肺癌中的表達及臨床意義

徐寶寧，張磊，田大力

（中國醫(yī)科大學附屬第四醫(yī)院胸外科，沈陽 110032）

世界范圍內(nèi)肺癌的發(fā)病率和死亡率均居惡性腫瘤之首，2008年世界范圍內(nèi)肺癌的新發(fā)病例為160萬，肺癌所致死亡病例達140萬［1］。非小細胞肺癌（non＆x100ccf;small cell lung cancer，NSCLC）是肺癌的最主要分型，約占全部肺癌的85%［2］。然而，大多數(shù)肺癌的早期癥狀并不特異。大約10%的患者在確診時尚無任何癥狀。對于NSCLC而言，約50%的患者在確診時已有轉(zhuǎn)移而失去了手術(shù)的機會［3］。研究NSCLC腫瘤標記物對NSCLC的早期診斷、預后分析以及研究靶向治療均有重要意義。

RhoA蛋白是小分子G蛋白Rho家族成員之一，參與細胞骨架的組裝、細胞黏附、細胞運動、細胞周期進展、細胞分裂及基因轉(zhuǎn)錄等多種生命過程的調(diào)節(jié)［4］。研究證實，Rho家族成員在胃癌、肝癌、食管癌和卵巢癌等多種癌組織中存在過度表達，并且與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［5～8］。本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)，RhoA mRNA在肺腺癌中高表達，且與肺腺癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床病理分期（tumor node metastasis，TNM）密切相關(guān)［9］。我們推測RhoA蛋白可能是NSCLC的腫瘤標記物，參與了NSCLC的發(fā)生發(fā)展過程。

本研究擬采用免疫組織化學法檢測RhoA蛋白在NSCLC組織及其對應的癌旁肺組織中的表達水平，探討其表達與NSCLC臨床病理資料的關(guān)系，并分析其與NSCLC預后的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

組織標本來自中國醫(yī)科大學附屬第四醫(yī)院行肺癌切除手術(shù)的78例患者。其中，肺腺癌42例，肺鱗癌36例。同時在78例對應的癌旁肺組織中隨機選取30例，作為對照組。排除手術(shù)后1個月內(nèi)死亡以及有其他臟器轉(zhuǎn)移、有其他腫瘤史以及術(shù)前接受過放化療及其他生物治療的患者。78例NSCLC中，男43例，女35例。年齡38～83歲，平均年齡61.47歲。根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）2009年對惡性腫瘤判定標準的第7次修訂［10］，對78例NSCLC患者分期分化進行判定。本研究已經(jīng)獲得中國醫(yī)科大學倫理委員會批準并與患者簽署了知情同意書。

1.2 免疫組織化學染色方法

手術(shù)切除的肺癌組織標本在甲醛中固定，石蠟包埋，3 μm連續(xù)切片。二甲苯和梯度乙醇脫蠟后，置于0.1 mol/L的檸檬酸緩沖液（pH6.0）高壓鍋沸騰3.0 min。應用抗人RhoA的單克隆抗體（abcam公司：ab54835）進行免疫組織化學染色。簡要步驟如下：滴加抗RhoA抗體（1∶200稀釋）后，切片置于4過夜，PBS沖洗3次后滴加二抗生物素化鼠/兔抗IgG（邁新公司：KIT＆x100ccf;9710）。DAB（邁新公司：KIT＆x100ccf;0017）染色后蘇木素復染。

1.3 免疫組織化學染色結(jié)果判定

RhoA蛋白的染色強度分為0分（無著色），1分（淡黃色），2分（黃色），3分（黃褐色）。著色面積百分比劃分為1分（≥1%～≤25%著色），2分（＆gt;25%～≤50%著色），3分（＆gt;50%～≤75%著色），4分（＆gt;75%～≤100%著色）。每個組織樣本的染色強度與百分比得分相乘后得出0～12分。規(guī)定組織表達為（-）：0分；（+）：1～4分；（++）：5～8分；（+++）：9～12分。（-）～（+）的組織樣本視為低表達樣本，（++）～（+++）的組織樣本視為高表達樣本。

1.4 統(tǒng)計學分析

用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，χ2檢驗驗證RhoA蛋白的表達與不同病理分型、性別、年齡、分化、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期的關(guān)系；應用Kaplan＆x100ccf;Meier預后分析法，判定RhoA蛋白的表達與患者預后的關(guān)系。P＆lt;0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 RhoA蛋白在NSCLC及癌旁肺組織中的表達

應用免疫組化法檢測RhoA蛋白在NSCLC及癌旁肺組織中的亞細胞定位以及表達情況。RhoA蛋白陽性表達物質(zhì)定位于上皮細胞胞質(zhì)內(nèi)，胞膜、胞核和間質(zhì)細胞中無發(fā)現(xiàn)，胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒者為陽性細胞（圖1）。結(jié)果顯示：RhoA蛋白在51例（65.4%）NSCLC組織中呈高表達，其中包括27例（64.3%）肺腺癌，24例（66.7%）肺鱗癌；在3例（10.0%）癌旁肺組織中高表達。RhoA蛋白在NSCLC組織中的表達率顯著高于癌旁肺組織（P＆lt;0.05），而在肺鱗癌和肺腺癌中的表達率無統(tǒng)計學差異（P＆lt;0.05）。見表1。

2.2 RhoA蛋白的表達與NSCLC患者臨床病理特征的關(guān)系

為了進一步探討RhoA蛋白在NSCLC發(fā)生發(fā)展過程中所扮演的角色，分析了78例NSCLC組織中RhoA蛋白的表達與臨床病理特征的關(guān)系。統(tǒng)計結(jié)果顯示：RhoA蛋白在NSCLC組織中的表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及TNM分期相關(guān)（P＆lt;0.05）；與年齡、性別、分化、腫瘤大小無關(guān)（P＆gt;0.05）。見表2。

圖1 免疫組化標記R hoA蛋白在非小細胞肺癌及癌旁肺組織中的表達情況 ×200Fig.1 Immunohistochemical staining of RhoA protein in NSCLC and para carcinoma tissues ×200

表1 R hoA蛋白在非小細胞肺癌組織中的表達情況Tab.1 Differential expression of RhoA protein in NSCLC tissue specimens

2.3 RhoA蛋白的表達與NSCLC患者無瘤生存期和總生存期的關(guān)系

Kaplan＆x100ccf;Meier分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)：RhoA蛋白高表達組患者的無進展生存期顯著低于RhoA蛋白低表達組（圖2A）。RhoA蛋白低表達組的患者的總生存期顯著高于RhoA蛋白高表達組（圖2B）。表明RhoA蛋白高表達提示NSCLC患者預后不良。

表2 R hoA蛋白的表達與非小細胞肺癌臨床病理特征之間的關(guān)系Tab.2 Association of RhoA expression with clinicopathological features from NSCLC

圖2 R hoA蛋白的表達與非小細胞肺癌患者無進展生存期（A）和總生存期（B）的關(guān)系Fig.2 Association of RhoA protein expression with event free（A）and overall（B）survival of patients with NSCLC

3 討論

本研究采用免疫組化法分析了RhoA蛋白在78例NSCLC組織和30例癌旁肺組織中的表達情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RhoA蛋白在肺鱗癌和肺腺癌組織中均呈現(xiàn)高表達，在癌旁肺組織中呈現(xiàn)低表達。RhoA蛋白與NSCLC患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、TNM分期以及預后顯著相關(guān)。因此，RhoA蛋白是NSCLC潛在的重要的生物學指標。

Rho蛋白是一種具有GTP酶活性的小分子G蛋白（small G proteinase，GTPase），主要包括 Rho、Rae、Cdc42 3個亞家族，至少包括23個成員。RhoA是小分子G蛋白Rho家族成員之一［4］。有活性的RhoA可以激活其下游的ROCK，PIP5K，MDIAL等蛋白，最終調(diào)節(jié)G＆x100ccf;actin與F＆x100ccf;actin之間的轉(zhuǎn)換，進而影響細胞形態(tài)和細胞運動能力。RhoA過表達能增加細胞的遷移侵襲和轉(zhuǎn)移能力［11］。有研究報道，應用小干擾RNA沉默RhoA表達并構(gòu)建重組質(zhì)粒，可以對乳腺癌細胞系的侵襲及轉(zhuǎn)移有顯著抑制作用［12］，提示RhoA可能在惡性腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。

本課題組前期在基因水平的研究中發(fā)現(xiàn)，肺腺癌中RhoA mRNA表達水平顯著高于對應癌旁肺組織［9］。本研究首次從蛋白水平完整報道了RhoA蛋白在NSCLC組織中的表達情況、與臨床病理資料的關(guān)系以及與患者預后的關(guān)系。我們推測，RhoA蛋白在NSCLC中的角色與在胃癌、肝癌、食管癌、卵巢癌等多種癌組織中的角色相近，通過增強腫瘤細胞運動能力，使腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力增強，腫瘤細胞表現(xiàn)出更強的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠處轉(zhuǎn)移能力，終使患者的無進展生存期和總生存期均顯著縮短。值得注意的是，目前尚未明確RhoA基因發(fā)生異常表達的根本原因，可能存在相關(guān)變異的基因序列也未得到闡述。進一步在基因?qū)用嫜芯縍hoA異常表達的原因，以及研究RhoA蛋白參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的生物學機制，研制針對變異基因或RhoA蛋白參與的致癌通路的阻止藥物，對RhoA相關(guān)的惡性腫瘤的治療有重要意義。

目前，雖然規(guī)范化的放化療和免疫治療可以改善進展期NSCLC患者的生存質(zhì)量，延長患者生存時間［13，14］，但進展期NSCLC患者的中位生存期只有1年，5年生存率僅有3.5%［15］。尋找NSCLC有效的治療靶點，對患者進行個體化的靶向治療，已成為治療NSCLC的新方向。本研究結(jié)果表明，RhoA可能在NSCLC的發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用，RhoA可否成為NSCLC有效的治療靶點有待于進一步深入研究。

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