補(bǔ)陽還五湯對(duì)APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠學(xué)習(xí)記憶及海馬組織白介素＆x100ccf;6水平的影響

費(fèi)洪新，韓玉生，杜徽，姜波，李寶龍，樸成玉，張英博，仲麗麗，白云，周忠光

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，哈爾濱 150040；2.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161000）

補(bǔ)陽還五湯（Buyang Huanwu Decoction，BHDWD）是中國(guó)古代活血祛瘀的方劑之一，其主要成分是黃芪甲苷、阿魏酸、芍藥苷、紅花黃色素等，具有補(bǔ)氣、活血、通絡(luò)等功效［1］。近年來本課題組成員應(yīng)用BHDWD對(duì)阿爾茨海默?。ˋlzheimer′s disease，AD）動(dòng)物模型開展多項(xiàng)研究，如BHDWD提高大鼠血清胰島素水平［2］、BHDWD降低大鼠β淀粉樣前體蛋白（amyloid precursor protein，APP）表達(dá)［3］、BHDWD降低細(xì)胞因子水平［4］、BHDWD增強(qiáng)免疫功能［5］等。APP與早老素1（presinilin＆x100ccf;1，PS1）密切相關(guān)，盡管對(duì)BHDWD的研究較多，但是BHDWD對(duì)AD的新模型APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠的研究尚屬空白。因此本實(shí)驗(yàn)采用AD模型APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠為研究對(duì)象，施加BHDWD處理因素進(jìn)行干預(yù)，觀察BHDWD對(duì)APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響，并且在此基礎(chǔ)上分析炎性相關(guān)因子白介素＆x100ccf;6（interleukin＆x100ccf;6，IL＆x100ccf;6）的變化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器：Morris水迷宮（安徽淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司）；6100型RT＆x100ccf;雷杜酶標(biāo)儀（美國(guó)RT公司）；電子天平（沈陽龍騰電子稱量?jī)x器有限公司）。

1.1.2 藥品和試劑：BHDWD（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院購(gòu)買、田明教授制備）；吡拉西坦片（湖南迪諾制藥有限公司，批號(hào)130325）；IL＆x100ccf;6酶聯(lián)免疫試劑盒（批號(hào)20140401，南京建成生物工程研究所生產(chǎn)）；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 動(dòng)物：健康、雄性、3月齡、清潔級(jí)、體質(zhì)量（23±2）g、APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠［B6.Cg＆x100ccf;Tg（APPswe，PSEN1dE9）85Dbo/Mmjax］，由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)解剖教研室吳樹亮教授贈(zèng)送，動(dòng)物自由攝取食物、飲用純凈水、常溫、常濕飼養(yǎng)于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，另外對(duì)照組小鼠（北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，SCXK（京）2012-0001與模型小鼠的飼養(yǎng)條件相同。

1.2 方法

1.2.1 APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠基因鑒定：APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因種鼠經(jīng)過傳代產(chǎn)下小鼠3周后鼠尾剪斷0.5 cm，提取基因組DNA，設(shè)計(jì)APP基因350 bp引物（上游：5′＆x100ccf;CACCACAGAATCCAAGTCGG＆x100ccf;3′，下游：5′＆x100ccf;CTTGACGTTCTGGCCTCTTCC＆x100ccf;3′），其余按Qiagen DNeasy Blood＆amp;Tissue Kit說明書進(jìn)行，篩選出APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠用于實(shí)驗(yàn)研究。

1.2.2 小鼠分組及其給藥：APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠共60只，隨機(jī)分5組：模型組12只給予生理鹽水灌胃、治療組12只給予吡拉西坦片（0.62 g·kg-1·d-1）灌胃、BHDWD高劑量組12只給予37.06 g·kg-1·d-1灌胃、BHDWD中劑量組12只給予18.53 g·kg-1·d-1灌胃、BHDWD低劑量組12只給予9.26 g·kg-1·d-1灌胃，另設(shè)立同月齡、同背景的C57小鼠對(duì)照組12只給予生理鹽水灌胃。灌胃時(shí)間每天上午8時(shí)，持續(xù)時(shí)間為4周。

1.2.3 BHDWD對(duì)APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠定位航行能力的影響：采用Morris水迷宮測(cè)試小鼠的學(xué)習(xí)能力，各組小鼠末次給藥1 h后進(jìn)行Morris水迷宮測(cè)試。Morris水迷宮水深20 cm，高于平臺(tái)1 cm，水溫控制在（23±2），平臺(tái)放于第象限，第1、2、3、4天時(shí)間為訓(xùn)練時(shí)間，第5天為測(cè)試時(shí)間，每次訓(xùn)練時(shí)間為60 s，若60 s內(nèi)未找到平臺(tái)，則將小鼠引至平臺(tái)停留20 s，此時(shí)潛伏期記為60 s，小鼠每次訓(xùn)練后都要在平臺(tái)上停留20 s，測(cè)試時(shí)撤去平臺(tái)，觀察小鼠到達(dá)平臺(tái)位置的時(shí)間，就是檢測(cè)定位航行能力的潛伏期時(shí)間，每只小鼠選擇3個(gè)不同的象限進(jìn)行測(cè)量，每組12只小鼠，即每組測(cè)得36個(gè)數(shù)值，再取平均值，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.4 BHDWD對(duì)APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠空間探索能力的影響：采用Morris水迷宮測(cè)試小鼠的記憶能力，過程同上，在測(cè)試第5 d的時(shí)候撤去平臺(tái)，檢測(cè)在60 s內(nèi)小鼠找到平臺(tái)的游泳距離作為衡量小鼠的空間探索能力的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，反映小鼠記憶能力的指標(biāo)。

1.2.5 BHDWD對(duì)APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠游泳軌跡的影響：采用Morris水迷宮觀察小鼠的游泳軌跡，過程同上，游泳軌跡一般分為邊緣型、趨化型、直線型3種，采用圖形的方式直觀反映小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶綜合能力。

1.2.6 BHDWD對(duì)APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠海馬IL＆x100ccf;6的影響：小鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，低溫迅速斷頭取海馬組織、勻漿、靜置、離心、分裝、低溫保存。采用雙抗體夾心法，按IL＆x100ccf;6酶聯(lián)免疫試劑盒說明書進(jìn)行，450 nm波長(zhǎng)測(cè)定各孔OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出海馬IL＆x100ccf;6濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 動(dòng)物小鼠基因的鑒定

結(jié)果表明，1、4、6三個(gè)樣本無APP基因，2、3、5、7四個(gè)樣本有APP基因，確定2、3、5、7四個(gè)樣本是APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠，依此方法鑒定APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠（圖1）。

圖1 APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠基因鑒定（PCR法）Fig.1 Gene identification of APP/PSI double transgenic mice（polymerase chain reaction method）

2.2 BHDWD對(duì)APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠定位航行能力的影響

結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，模型組小鼠潛伏期明顯增加（P＆lt;0.05）；與模型組比較，治療組、高劑量組、中劑量組的小鼠潛伏期明顯縮短（P＆lt;0.05）；與模型組比較，低劑量組的小鼠潛伏期改變差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＆gt;0.05，表1）。

2.3 BHDWD對(duì)APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠空間探索能力的影響

表1 BHD對(duì)APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠海馬組織潛伏期的影響（±s，n=12）Tab.1 Effect of BHD on the latencies of hippocampal tissue in APP/PS1 double transgenic mice（±s，n=12）

表1 BHD對(duì)APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠海馬組織潛伏期的影響（±s，n=12）Tab.1 Effect of BHD on the latencies of hippocampal tissue in APP/PS1 double transgenic mice（±s，n=12）

1）P＆lt;0.05 compared to control group；2）P＆lt;0.05，3）P＆gt;0.05 compared to model group.

Group Dosage（g·kg-1·d-1） Latencies（s）Control group - 17.950 8±10.462 7 Model group - 40.885 0±12.961 51）Treatment group 0.62 19.611 7±10.203 82）High dose group 37.06 28.375 0±13.140 52）Medial dose group 18.53 25.469 2±9.519 22）Low dose group 9.26 36.994 2±11.295 93）

結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，模型組小鼠游泳距離明顯增加（P＆lt;0.05）；與模型組比較，治療組、高劑量組、中劑量組的小鼠游泳距離明顯縮短（P＆lt;0.05）；與模型組比較，低劑量組的小鼠游泳距離改變差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＆gt;0.05）；與治療組比較，高劑量組的小鼠游泳距離明顯延長(zhǎng)（P＆lt;0.05），中劑量組的小鼠游泳距離改變差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＆gt;0.05，表2）。

表2 BHD對(duì)APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠游泳距離的影響（±s，n=12）Tab.2 Effect of BHD on swimming distances of APP/PS1 double transgenic mice（±s，n=12）

表2 BHD對(duì)APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠游泳距離的影響（±s，n=12）Tab.2 Effect of BHD on swimming distances of APP/PS1 double transgenic mice（±s，n=12）

1）P＆lt;0.05 compared to control group；2）P＆lt;0.05，3）P＆gt;0.05 compared to model group；4）P＆lt;0.05，5）P＆gt;0.05 compared to treatment group.

Groups Dosage（g·kg-1·d-1） Swimming distances（cm）Control group - 625.583 3±194.140 0 Model group - 1286.175 8±132.135 01）Treatment group 0.62 709.400 0±173.284 92）High dose group 37.06 868.870 8±186.985 12），4）Medial dose group 18.53 754.148 3±141.388 42），5）Low dose group 9.26 1180.068 3±121.275 83）

2.4 BHDWD對(duì)APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠游泳軌跡的影響

圖2 BHD對(duì)APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠海馬組織第Ⅰ象限游泳軌跡的影響Fig.2 Effect of BHD on swimming trajectory of the first quadrant of hippocampal tissue in APP/PS1 double transgenic mice

圖3 BHD對(duì)APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠海馬組織第Ⅱ象限游泳軌跡的影響Fig.3 Effect of BHD on swimming trajectory of the second quadrant of hippocampal tissue in APP/PS1 double transgenic mice

圖4 BHD對(duì)APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠海馬組織第Ⅲ象限游泳軌跡的影響Fig.4 Effect of BHD on swimming trajectory of the third quadrant of hippocampal tissue in APP/PS1 double transgenic mice

2.5 BHDWD對(duì)APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠海馬組織IL＆x100ccf;6的影響

結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，模型組小鼠海馬組織IL＆x100ccf;6含量明顯升高（P＆lt;0.05）；與模型組比較，治療組、高劑量組、中劑量組小鼠海馬組織IL＆x100ccf;6的含量明顯降低（P＆lt;0.05）；與模型組比較，低劑量組小鼠海馬組織IL＆x100ccf;6含量降低不明顯（P＆gt;0.05，表3）。

表3 BHD對(duì)APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠海馬組織IL＆x100ccf;6的影響（±s，n=12）Tab.3 Effect of BHD on IL 6 of hippocampal tissue in APP/PS1 double transgenic mice（±s，n=12）

表3 BHD對(duì)APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠海馬組織IL＆x100ccf;6的影響（±s，n=12）Tab.3 Effect of BHD on IL 6 of hippocampal tissue in APP/PS1 double transgenic mice（±s，n=12）

1）P＆lt;0.05 compared to control group；2）P＆lt;0.05，3）P＆gt;0.05 compared to model group.

Group Dosage（g·kg-1·d-1）Hippocampal（ng·mL-1）Control group - 6.514 1±0.618 9 Model group - 9.495 6±0.566 01）Treatment group 0.62 7.102 1±0.434 12）High dose group 37.06 8.506 9±0.421 02）Medial dose group 18.53 7.834 4±0.500 72）Low dose group 9.26 9.316 3±0.479 93）

3 討論

AD經(jīng)常隱匿起病，出現(xiàn)進(jìn)行性的智能衰退，經(jīng)常伴有人格的障礙，在AD的發(fā)生早期表現(xiàn)為學(xué)習(xí)、記憶能力的減退，基于此本實(shí)驗(yàn)主要檢測(cè)APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，并且探尋與小鼠學(xué)習(xí)、記憶能力相關(guān)的細(xì)胞因子。

AD的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，細(xì)胞因子也參與AD的發(fā)生機(jī)制。細(xì)胞因子由淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞產(chǎn)生，對(duì)機(jī)體起到調(diào)節(jié)作用，在AD的發(fā)生中會(huì)出現(xiàn)小膠質(zhì)細(xì)胞炎性反應(yīng)，炎癥初期小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)吞噬受體清除AD的核心成分、老年斑的主體結(jié)構(gòu)β＆x100ccf;淀粉樣蛋白（amyloidbeda protein，Aβ）［6］，Aβ使小膠質(zhì)細(xì)胞激活釋放，小膠質(zhì)細(xì)胞又可以使Aβ產(chǎn)生增加，形成瀑布式效應(yīng)，導(dǎo)致Aβ增加，使機(jī)體AD的癥狀加劇。在引發(fā)AD時(shí)，主要的細(xì)胞因子是IL＆x100ccf;6、TNF＆x100ccf;α、IL＆x100ccf;1β等［7，8］?；诖耍緦?shí)驗(yàn)同時(shí)開展對(duì)IL＆x100ccf;6的檢測(cè)。

AD的研究有很多模型，例如快速老化小鼠模型、注射D＆x100ccf;半乳糖模型、注射Aβ模型、鋁中毒模型、轉(zhuǎn)基因模型等［9］。近年來很多研究者采用APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠來開展實(shí)驗(yàn)［10～12］。APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠是在C57小鼠幼年時(shí)期就轉(zhuǎn)入2種AD相關(guān)基因，制備AD模型，基于此本實(shí)驗(yàn)采用APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠為研究對(duì)象，以中國(guó)古老的方劑BHDWD為處理因素，主要研究BHDWD對(duì)APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠海馬組織的保護(hù)作用。

實(shí)驗(yàn)潛伏期、游泳距離的檢測(cè)中，隨著訓(xùn)練次數(shù)的增加，潛伏期、游泳距離整體呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。第5天與對(duì)照組比較，模型組小鼠游泳距離明顯增加，說明模型建立成功，模型穩(wěn)定；第5天測(cè)試后與模型組比較，治療組、高劑量組、中劑量組小鼠游泳距離明顯縮短，說明高劑量、中劑量的BHDWD對(duì)APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠的治療也有效果；但是第5天測(cè)試后與模型組比較，低劑量組小鼠游泳距離改變不明顯，也說明低劑量的BHDWD對(duì)AD小鼠治療效果較差，以上綜合提示在臨床治療中，應(yīng)該選擇高、中劑量BHDWD。中劑量BHDWD對(duì)APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠的記憶能力改善明顯，高劑量的BHDWD雖然有效果，但是有一定的不良反應(yīng)，因此建議選擇中劑量BHDWD效果較好。

實(shí)驗(yàn)游泳軌跡的觀察中顯示模型組、低劑量組小鼠的游泳軌跡多為邊緣型，說明低劑量的BHDWD改善APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力不明顯；對(duì)照組、治療組、高劑量組、中劑量組小鼠的游泳軌跡多為直線型和趨化型，說明高劑量、中劑量的BHDWD可以提高AD小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力，并且中劑量的BHDWD與吡拉西坦片的圖形接近，進(jìn)一步說明中劑量的BHDWD改善AD小鼠學(xué)習(xí)記憶能力較好。

實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)細(xì)胞因子IL＆x100ccf;6，與對(duì)照組比較，模型組AD小鼠海馬組織IL＆x100ccf;6含量明顯升高，說明模型組炎性反應(yīng)明顯，模型建立成功；治療后與模型組比較，治療組、高劑量組、中劑量組APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠海馬組織IL＆x100ccf;6的含量明顯降低，提示高、中劑量的BHDWD對(duì)改善AD小鼠炎性反應(yīng)癥狀明顯，說明高、中劑量BHDWD對(duì)AD治療效果較好；經(jīng)過BHDWD治療后與模型組比較，低劑量組小鼠海馬組織IL＆x100ccf;6含量較高，說明低劑量BHDWD對(duì)改善AD小鼠IL＆x100ccf;6水平效果不好。通過對(duì)細(xì)胞因子IL＆x100ccf;6的檢測(cè)中提示IL＆x100ccf;6與AD密切相關(guān)，并且中劑量的BHDWD對(duì)改善APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠效果較好

總之，本研究發(fā)現(xiàn)BHDWD改善APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠學(xué)習(xí)、記憶能力，降低IL＆x100ccf;6的水平，說明BHDWD通過下調(diào)海馬組織IL＆x100ccf;6的水平來干擾炎癥的損傷過程，減輕AD的癥狀，保護(hù)小鼠海馬組織結(jié)構(gòu)，改善APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠的學(xué)習(xí)、記憶能力。關(guān)于BHDWD治療AD的作用機(jī)制，本課題組將繼續(xù)深入開展RAGE/LRP1受體系統(tǒng)的研究，探尋BHDWD治療AD的新靶點(diǎn)。

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