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    PI3K/AKt/eNOS信號(hào)通路在硫化氫抑制ET-1誘導(dǎo)的心肌肥大中的作用

    2014-12-02 03:49:06王雅婧張學(xué)志刁力王其新
    關(guān)鍵詞:培養(yǎng)液磷酸化心肌細(xì)胞

    王雅婧,張學(xué)志,刁力,王其新

    硫化氫氣體(H2S)自被發(fā)現(xiàn)具有類似一氧化氮(NO)和一氧化碳的某些生理作用后,在心血管、神經(jīng)、消化等多個(gè)系統(tǒng)受到諸多關(guān)注。研究[1]顯示內(nèi)源性H2S發(fā)揮舒張血管、調(diào)節(jié)血壓的效應(yīng)在NO存在的條件下能夠明顯增強(qiáng)。PI3K上調(diào)AKt的磷酸化以激活內(nèi)皮型-一氧化氮合酶(eNOS),是調(diào)控內(nèi)源性NO合成的最經(jīng)典途徑之一。邊云飛等[2]在應(yīng)用過氧化氫誘導(dǎo)建立心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激模型的過程中發(fā)現(xiàn),硫氫化鈉預(yù)處理能使Akt的磷酸化水平升高,在一定程度上減輕心肌細(xì)胞損傷及凋亡,發(fā)揮保護(hù)作用。也有研究[3]顯示在缺血預(yù)適應(yīng)時(shí),H2S可通過上調(diào)AKt/eNOS信號(hào)通路來改善心肌損傷,ET-1作為肥大刺激因子是研究較多的因子之一,已經(jīng)證實(shí)[4]其最佳有效濃度約為10-9~10-7mol/L。本實(shí)驗(yàn)旨在通過ET-1建立心肌肥大模型,探索H2S能否通過上述信號(hào)通路抑制ET-1的誘導(dǎo)效應(yīng),并尋找可能有效的抑制方法。

    1 材料與方法

    1.1 動(dòng)物與主要試劑 清潔級(jí)Wistar乳鼠,1~3日齡,由青島派特福德白鼠養(yǎng)殖專業(yè)合作社提供;內(nèi)皮素-1、5′-溴-2-脫氧尿嘧啶核苷(5'-BrdU)由Sigma公司提供;胰蛋白酶、高糖DMEM、青霉素+鏈霉素、胎牛血清等均購自Hyclone公司;膠原酶Ⅱ型、RIPA細(xì)胞裂解液由北京索來寶公司提供;兔抗AKt抗體和兔抗磷酸化AKt抗體購自美國CST公司;總RNA提取試劑盒購自O(shè)miga公司;BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒由碧云天生物技術(shù)研究所提供;NO濃度測(cè)試盒由南京建成生物工程研究所提供。

    1.2 方法

    1.2.1 肥大心肌細(xì)胞模型的建立及細(xì)胞分組 胰蛋白酶和膠原酶Ⅱ消化法獲取心肌細(xì)胞并接種到培養(yǎng)板,滴入5'-BrdU使其終濃度為0.1 mmol/L,培養(yǎng)72 h后將細(xì)胞分為對(duì)照組、肥大組和實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行處理,為了解H2S的有效藥物濃度,因此采用不同濃度梯度的NaHS對(duì)實(shí)驗(yàn)組進(jìn)一步進(jìn)行處理,具體如下:①對(duì)照組:加入等體積無血清的DMEM培養(yǎng)基;②肥大組:加入終濃度為10-8mol/L 的ET-1;③10-15M NaHS組:加入10-15mol/lNaHS+10-8mol/L ET-1;④10-14M NaHS組:加入10-14mol/L NaHS+10-8mol/L ET-1;⑤10-13M NaHS組:加入10-13mol/L NaHS+10-8mol/L ET-1;⑥10-12M NaHS組:加入10-12mol/L NaHS+10-8mol/L ET-1。

    1.2.2 心肌細(xì)胞表面積的測(cè)定 參照文獻(xiàn)方法[5],ET-1和或NaHS持續(xù)刺激24 h后用ImageJ圖像處理軟件測(cè)定心肌細(xì)胞的表面積,每個(gè)孔測(cè)5個(gè)視野,每個(gè)視野測(cè)10~15個(gè)細(xì)胞,取其平均值,作為細(xì)胞形態(tài)學(xué)的指標(biāo)。

    1.2.3 培養(yǎng)液NO含量和各組細(xì)胞總蛋白含量的測(cè)定 各組實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,獲取待測(cè)培養(yǎng)液,按照NO含量測(cè)定試劑盒說明書操作,酶標(biāo)儀550 nm比色,測(cè)定各組OD值,NO含量(umol/L)= (測(cè)定OD值-空白OD值)/(標(biāo)準(zhǔn)OD值-空白OD值)×標(biāo)準(zhǔn)品濃度×稀釋倍數(shù);用RIPA細(xì)胞裂解液獲得細(xì)胞蛋白液,根據(jù)BCA法測(cè)定試劑盒說明書操作,酶標(biāo)儀562 nm比色,對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線,測(cè)定細(xì)胞總蛋白質(zhì)濃度。

    1.2.4 Western Blot法檢測(cè)AKt蛋白的表達(dá) 分別提取各組細(xì)胞蛋白30 μg,聚丙烯酰胺變性凝膠分離,濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜,5%脫脂奶粉封閉1.5 h,加一抗(AKt或磷酸化AKt 1:1000稀釋,GAPDH 1:3000稀釋)4℃過夜孵育,洗膜,加辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1:6000稀釋)室溫下孵育1 h。洗膜,ECL顯色,凝膠成像儀及Quanlity One軟件顯影。以GAPDH為內(nèi)參,計(jì)算各組AKt表達(dá)的相對(duì)量。每組重復(fù)3次。

    1.2.5 PCR法檢測(cè)心房鈉利尿肽(ANP)、腦鈉肽(BNP)、eNOS mRNA的表達(dá) 用總RNA提取試劑盒提取各組細(xì)胞總RNA,A260/A280測(cè)定總RNA純度和濃度,取100 ng遵照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA。根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫提供的ANP、BNP、PI3K、AKt、eNOS和β-action mRNA基因序列,由上海生工公司合成6對(duì)引物。ANP引物序列為:Forward:5'-ACCGAAGATAA CAGCCAAATC-3',Reverse:5'-GGGTATTCACC ACCTCTCAGTG-3',PCR反應(yīng)產(chǎn)物107bP,退火溫度61.5℃;BNP引物序列為:Forward:5'-GA GACAAGAGAGAGCAGGACAC -3',Reverse:5'-GAAAAGCAGGAGCAGAATCATC -3',PCR反應(yīng)產(chǎn)物103bP,退火溫度63℃;PI3K引物序列為:Forward:5'-AAGCCTCTTCCTCCTCCAAT -3',Reverse:5'-ACGATGGGTCAAATCCACTT -3',PCR反應(yīng)產(chǎn)物374bP,退火溫度62℃;AKt引物序列為:Forward:5'-GCCCACACGCTTACTGAGA-3',Reverse:5'-AGCCCGAAGTCCGTTATCTT-3',PCR反應(yīng)產(chǎn)物308bP,退火溫度62℃;eNOS引物序列為:Forward:5'-AGGTA TTTGATGCTCGGGACTG -3',Reverse:5'-AAGATTGCCTCGGTTTGTTG -3',PCR反應(yīng)產(chǎn)物97bP,退火溫度65℃;β-action引物序列為:Forward:5'-CACCCGCGAGATCAACCTTC-3',Reverse:5'-CCCATACCCACCATCACACC-3',PCR反應(yīng)產(chǎn)物324bP,退火溫度59℃。以cDNA為模板,分別進(jìn)行ANP、BNP、PI3K、AKt、eNOS和β-action的共同擴(kuò)增。反應(yīng)體系為20 ul,擴(kuò)增條件:94℃,5 min進(jìn)入循環(huán);94℃,30 s,退火溫度30 s,72℃,30 s,循環(huán)35次;72℃,7 min。使用PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳分離。

    2 結(jié)果

    2.1 各組心肌細(xì)胞表面積結(jié)果 與對(duì)照組相比,ET-1組心肌細(xì)胞表面積明顯增加(P<0.05),10-15mol/L-10-12mol/L NaHS可濃度依賴性的降低細(xì)胞表面積(F=1078.00,P<0.01),見表1。

    2.2 各組心肌細(xì)胞總蛋白含量結(jié)果 與對(duì)照組相比,ET-1組心肌細(xì)胞總蛋白含量明顯增加,NaHS可濃度依賴性的抑制各組心肌細(xì)胞蛋白合成(F=209.09,P<0.01)見表1。

    2.3 各組培養(yǎng)液NO含量結(jié)果 ET-1組較對(duì)照組能夠明顯降低NO含量(P<0.05),給予NaHS刺激后NO含量隨藥物濃度的升高而逐漸增加(F=87.69,P<0.05),10-12mol/L NaHS組可基本恢復(fù)至正常水平(P>0.05),見表1。

    2.4 各組ANP、BNP mRNA水平檢測(cè)結(jié)果 ET-1組與對(duì)照組比較結(jié)果有顯著差異(P<0.05),不同濃度的NaHS能夠不同程度的抑制ANP mRNA合成(FANP=27.88,F(xiàn)BNP=12.58,P<0.05),10-13mol/L、10-12mol/L NaHS組較10-15mol/L、10-14mol/L NaHS組抑制BNP mRNA合成的效應(yīng)明顯(P<0.05),兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見圖1、2。

    2.5 各組PI3K、AKt、eNOS mRNA表達(dá)結(jié)果 ET-1顯著降低了PI3K/AKt/eNOS通路三者的mRNA水平(P<0.05),NaHS能夠濃度依賴性的改善表達(dá)量(FPI3K=48.63,F(xiàn)AKt=85.88,F(xiàn)eNOS=35.60,P<0.05),但10-15mol/L組和10-14 mol/L組的PI3K、AKt水平,10-13mol/L組和10-12 mol/L組的eNOS水平無明顯差異(P>0.05),見圖3、4、5。

    表1 各組心肌細(xì)胞表面積、總蛋白含量、培養(yǎng)液NO含量測(cè)定結(jié)果(±s)

    表1 各組心肌細(xì)胞表面積、總蛋白含量、培養(yǎng)液NO含量測(cè)定結(jié)果(±s)

    注:與①對(duì)照組比較,aP<0.01;與②肥大組比較,bP<0.01;各組間比較,P<0.05

    測(cè)定指標(biāo) ①對(duì)照組 ②肥大組(ET-1) ③10-15M NaHS組 ④10-14 M NaHS組 ⑤10-13 M NaHS組 ⑥10-12M NaHS組心肌細(xì)胞表面積(n=75),um2/cell 787.27±107.66 1933.80±143.06a 1785.20±73.77ab 1574.00±158.41ab 1194.90±120.60ab 831.87±148.93b心肌細(xì)胞總蛋白含量(n=27),ug/ml 218.55±21.28 367.51±25.90 346.49±22.11 319.33±18.78 289.52±17.55 243.31±19.05培養(yǎng)液NO含量(n=9),umol/L 8.63±0.30 4.60±0.73 5.29±0.65 6.41±0.56 7.29±0.38 8.26±0.31a

    圖1 不同濃度NaHS對(duì)ET-1誘導(dǎo)的肥大心肌ANP mRNA表達(dá)量的影響

    圖2 不同濃度NaHS對(duì)ET-1誘導(dǎo)的肥大心肌BNP mRNA表達(dá)量的影響

    圖3 不同濃度NaHS對(duì)ET-1誘導(dǎo)的肥大心肌PI3K mRNA表達(dá)量的影響

    圖4 不同濃度NaHS對(duì)ET-1誘導(dǎo)的肥大心肌AKt mRNA表達(dá)量的影響

    2.6 各組磷酸化AKt蛋白表達(dá)量結(jié)果 ET-1組AKt的磷酸化水平低于正常組(P<0.01),NaHS能夠有效改善這種抑制效應(yīng),恢復(fù)AKt的磷酸化水平(F=36.10,P<0.01),但仍低于正常水平(P<0.05),且10-13mol/L、10-12mol/L NaHS的作用差異不顯著(P>0.05)見圖6。

    圖5 不同濃度NaHS對(duì)ET-1誘導(dǎo)的肥大心肌eNOS mRNA表達(dá)量的影響

    圖6 不同濃度NaHS對(duì)ET-1誘導(dǎo)的肥大心肌磷酸化AKt表達(dá)量的影響

    3 討論

    既往研究[6]提示ET-1能夠在納摩爾水平通過多種調(diào)控方式包括L型鈣通道、鈣激活氯通道、蛋白激酶C和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)通路等增加細(xì)胞蛋白質(zhì)合成,誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大,有效建立心肌肥厚模型。早期高血壓機(jī)制研究已經(jīng)證實(shí)ET-1內(nèi)源性的生成與NO存在動(dòng)態(tài)平衡,兩者相互拮抗維持正常心血管的生理作用[7]。在心血管系統(tǒng)中NO主要由內(nèi)皮型NOS(eNOS)催化底物左旋精氨酸合成,心肌細(xì)胞本身可于細(xì)胞膜和橫管之間的小窩處合成eNOS,后者與小窩受體通過caveolin-3形成eNOS-caveolin-3-小窩受體復(fù)合物[8]。包括內(nèi)皮素受體、緩激肽β2受體、β3-腎上腺素能受體等多種受體便可以與eNOS在小窩處共定位,發(fā)揮相應(yīng)的生物作用[9-11]。與野生型小鼠的離體心肌細(xì)胞相比,eNOS基因敲除的小鼠離體心肌細(xì)胞對(duì)心肌肥大誘導(dǎo)藥物的敏感性升高出現(xiàn)過度增殖反應(yīng)[12]。在本實(shí)驗(yàn)中,外源性給予ET-1誘導(dǎo)處理后,eNOS mRNA的表達(dá)量及培養(yǎng)液NO含量較對(duì)照組減少,ET-1/NO平衡被打破,同時(shí)心肌細(xì)胞表面積及蛋白含量、ANP及BNP mRNA水平均明顯增加,證實(shí)了通過破壞該平衡能夠建立較完善的實(shí)驗(yàn)?zāi)P汀?/p>

    本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在ET-1誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大下,PI3K、AKt、eNOS mRNA的表達(dá)均被明顯抑制,AKt蛋白下調(diào),培養(yǎng)液中NO的釋放也減少,這些結(jié)果提示PI3K-AKt-eNOS信號(hào)途徑受損在ET-1誘導(dǎo)心肌肥大過程中有重要意義。在應(yīng)用NaHS處理肥大的心肌細(xì)胞后,磷酸化AKt表達(dá)上調(diào),PI3K、AKt、 eNOS mRNA的表達(dá)量及培養(yǎng)液NO含量均較肥大組明顯增加,提示該藥物可能通過PI3K-AKt-eNOS信號(hào)途徑改善NO的合成,抑制ET-1的生成水平。在上述指標(biāo)中,NO含量的變化與信號(hào)通路的變化不完全相同,尤其以10-12mol/L NaHS組為著,提示在該信號(hào)通路控制NO生成的過程中可能存在其他因子的正向調(diào)節(jié),促進(jìn)上游AKt、eNOS的活性表達(dá)。

    雖然給予較低濃度的NaHS(10-15-10-14mol/L)后,兩組eNOS與NO水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但在PI3K及AKt水平變化并不顯著。PI3K具有絲氨酸/蘇氨酸(Ser/Thr)激酶活性,在被G蛋白偶聯(lián)受體、蛋白酪氨酸激酶受體和Ras蛋白活化后產(chǎn)生第二信使磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸(Phosphatidylinositol 3,4,5-triphosphate,PIP3),它能與AKt氨基末端的PH結(jié)構(gòu)域結(jié)合,使AKt發(fā)生構(gòu)象改變并暴露Thr308和Ser473磷酸化位點(diǎn),進(jìn)一步激活下游底物形成較完整獨(dú)立的信號(hào)通路。既往也有研究[13]顯示,ET-1作為屬于G蛋白偶聯(lián)家族受體配體,可激活PI3K/AKt信號(hào)通路,滅活GSK3β,抑制其參與的負(fù)向調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞肥大的過程[14]。兩種截然相反的實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示在ET-1誘導(dǎo)心肌肥大的過程中,雖存在PI3K/AKt/eNOS信號(hào)通路的受損,但少量存留的磷酸化PI3K、AKt仍可以激活其他通路的下游底物促進(jìn)ET-1的肥大效應(yīng),二者可能同時(shí)具有相反的生物效應(yīng),H2S是否也能通過調(diào)節(jié)其他信號(hào)通路抑制心肌肥大尚需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

    綜上所述,H2S可能通過PI3K/AKt/eNOS信號(hào)通路抑制ET-1誘導(dǎo)的心肌肥大,但在激活PI3K/AKt通路后除eNOS外有無調(diào)控其他下游效應(yīng)分子發(fā)揮作用需要進(jìn)一步探討。

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