超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法研究克倫特羅在絨山羊體內(nèi)消除規(guī)律

王麗娜，劉 凱，李延山，杜柏林，張 明

(遼寧省獸藥飼料畜產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測中心，沈陽110016)

克倫特羅添加到飼料中，能有效地促進(jìn)畜禽蛋白質(zhì)合成和肌肉組織生長，減少皮下脂肪的沉積，提高瘦肉率和飼料轉(zhuǎn)化率［1］，在畜禽養(yǎng)殖中具有可觀的經(jīng)濟(jì)效益。由于利益的驅(qū)動，在畜牧養(yǎng)殖環(huán)節(jié)出現(xiàn)了以克倫特羅為代表的β－受體激動劑(俗稱“瘦肉精”)的濫用，導(dǎo)致其在動物體內(nèi)蓄積殘留，消費(fèi)者購買帶有藥物殘留的畜禽產(chǎn)品就會引起急性中毒［2］。近年來，國內(nèi)外發(fā)生了多起由于食用了瘦肉精飼喂的動物產(chǎn)品而導(dǎo)致的中毒事件，中毒事件的不斷發(fā)生使得各國相繼出臺禁令。農(nóng)業(yè)部于1997年3月［農(nóng)牧發(fā)(1997)］3號文嚴(yán)令禁止克倫特羅等β－激動劑在動物生產(chǎn)中的應(yīng)用。目前有文獻(xiàn)［1］報道豬體內(nèi)克倫特羅的殘留消除規(guī)律，尚未見克倫特羅在絨山羊體內(nèi)消除規(guī)律研究的報道。本研究建立了檢測絨山羊尿液、肝臟、腎臟、肺臟、肌肉中克倫特羅的UPLC－MS/MS方法，并對克倫特羅在絨山羊體內(nèi)的消除規(guī)律進(jìn)行了系統(tǒng)研究。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與樣品采集 參照文獻(xiàn)［3－5］報道，選取體重約為(30±4.8)kg絨山羊60只，隨機(jī)分為2組(A、B組)，每組30只。常規(guī)飼養(yǎng)，自由飲水，飼料為配合日糧。A組給藥濃度為150 μg/kg b.w.，B 組給藥濃度為300 μg/kg b.w.。連續(xù)給藥25 d后停藥。停藥后第1天、第3天、第5天、第7天、第10天、第15天 、第20天、第25天、第30天、第40天每組每個測試時間點隨機(jī)取3只宰殺，每只動物取上述4種組織樣品(肝臟、肺、腎臟、肌肉)。每組隨機(jī)取8只絨山羊，每天對其尿液進(jìn)行監(jiān)測。

1.2 儀器與材料 液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜儀:Waters Quattro premierXE;高速冷凍離心機(jī)(Biofuge STRATOS Centrifuge);均質(zhì)器(PRO250);氮吹儀(OASYS);MilliQ超純水器(美國Millipore公司);甲醇、甲酸、氨水、高氯酸、MCX固相萃取小柱。

1.3 儀器條件 根據(jù)文獻(xiàn)［6－7］方法，儀器條件如下。色譜柱:BEH C18(50 mm ×2.1 mm，1.7 μm)。流動相A:甲醇;B:0.1%甲酸水溶液;流速0.3 mL/min。梯度洗脫程序，0～5.0 min，4%A 線性變化至 60%，5.0 ～5.1 min，60%A 線性變化至40%A，5.1～6.0 min維持4%A。柱溫40 ℃，進(jìn)樣量10 μL。

電噴霧正離子掃描(ESI+);監(jiān)測方式:多反應(yīng)監(jiān)測(MRM);電壓3.2 kV;源溫120℃;霧化氣溫度350℃;錐孔氣流速50 L/h;霧化氣流速650 L/h;定性定量離子對及錐孔電壓、碰撞能量見表1。

表1 克倫特羅及其內(nèi)標(biāo)定性、定量離子對及碰撞電壓、錐孔電壓表

1.4 溶液的配制

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 精密稱取克倫特羅對照品，以甲醇為溶劑配成濃度各約1 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲備液，2～8℃冷藏保存。準(zhǔn)確吸取適量上述標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用0.2%甲酸水溶液稀釋成濃度為10 μg/L對照品標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.4.2 內(nèi)標(biāo)溶液配制 精密稱取克倫特羅－D9同位素內(nèi)標(biāo)，以甲醇為溶劑配成濃度約為10 mg/mL的同位素內(nèi)標(biāo)儲備液。取同位素內(nèi)標(biāo)儲備液，用0.2%甲酸水溶液稀釋成濃度為40 μg/L對照品標(biāo)準(zhǔn)液，2～8℃冷藏保存，有效期1個月。

1.5 樣品的提取與凈化［3］

1.5.1 提取 取尿液5.0 mL(組織2.00 g)于50 mL離心管中，添加內(nèi)標(biāo)工作液100 μL，充分混勻。加入40 μL β－葡萄糖醛酸－芳基硫酸酯酶，15 mL 0.2 mol/L 醋酸銨緩沖溶液(pH 5.2)，37.0 ℃震蕩水浴16 h，加入0.5 mL高氯酸，渦旋混勻，10000 r/min離心5 min。

1.5.2 凈化 固相萃取小柱用3 mL甲醇、3 mL水、3 mL 2%甲酸水溶液活化，將上述提取液全部過柱，3 mL 2%甲酸水溶液，3 mL甲醇淋洗?？諝獬楦?。5 mL 5%氨水甲醇溶液洗脫。收集洗脫液，40℃氮?dú)獯蹈珊螅?.0 mL 0.2%甲酸水溶液溶解，經(jīng) 0.22 μm 水系微孔濾膜過濾后，供UPLC－MS/MS分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 分析條件的優(yōu)化 β－受體激動劑在C18柱上的保留性較好，本研究比較了幾種類型的C18色譜柱 ACQUITY UPLC BEH C18 1.7 μm、ACQUITY UPLC HSS C18、ACQUITY UPLC HSS T3 柱的分析結(jié)果，結(jié)果顯示，ACQUITY UPLC BEH C18上的保留時間及分離度均比較理想，因此選擇該柱為分析柱。先后采用乙腈和水、甲醇和0.1%甲酸溶液［6］、乙腈和0.1%甲酸溶液［7］、甲醇和水、甲醇和5 mmol/L乙酸銨幾種流動相進(jìn)行分析，結(jié)果顯示流動相為甲醇和0.1%甲酸溶液時靈敏度最高、重復(fù)性最好。因此選擇甲醇和0.1%甲酸溶液為流動相。

用500 μg/L的激動劑標(biāo)準(zhǔn)溶液以流動注射的方式分別用ESI+和ESI－模式進(jìn)行全掃描，發(fā)現(xiàn)克倫特羅在ESI+電離模式下響應(yīng)值大大高于ESI－模式下的響應(yīng)值，因此采用ESI+電離模式。對毛細(xì)管電壓進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果在3.2 kV響應(yīng)值最大，對母離子產(chǎn)生的子離子及碰撞能量進(jìn)行優(yōu)化，從中選出豐度較高的子離子作為定性和定量離子。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 方法專屬性考察 對照品溶液色譜圖見圖1。取空白樣品，按1.5項操作，得圖2～圖6。在上述條件下，樣品雜質(zhì)無干擾，專屬性良好。

2.2.2 線性范圍、檢出限、定量限 配置標(biāo)準(zhǔn)曲線，濃度分別為 0.5、1、5、10、25、50、100 μg/L，以待測物濃度為橫坐標(biāo)(X，μg/L)，以標(biāo)準(zhǔn)溶液中被測組分峰與內(nèi)標(biāo)面積的比值為縱坐標(biāo)(Y)，進(jìn)行回歸運(yùn)算。Y=1.168X+1.346，r2=0.998(n=2)。當(dāng)添加0.1 μg/L 克倫特羅時，信/噪(S/N)比大于3，檢測限為0.1 μg/L。取空白樣品制備添加濃度0.2 μg/L 樣品(n=6)，信/噪(S/N)比均大于 10，因此定量限為 0.2 μg/L(圖7、圖8)。

2.2.3 方法的精密度 按1.5項操作，制備低、中、高三個濃度水平，分別為 0.2、0.4、2(尿液為μg/L，其他組織為μg/kg)的質(zhì)量控制(QC)樣品，每一濃度進(jìn)行6樣本分析，根據(jù)當(dāng)日的標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行樣品的濃度測定。結(jié)果表明，精密度在2.5%～18.9%(表2)之間。

2.2.4 回收率試驗 按1.5項操作，制備低、中、高三個濃度水平，分別為0.2、0.4、2(尿液為 μg/L，其他組織為μg/kg)的質(zhì)量控制(QC)樣品，每一濃度進(jìn)行6樣本分析，根據(jù)當(dāng)日的標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行樣品的濃度測定。結(jié)果表明，回收率在87.5% ～116.1%(表2)之間。

表2 尿液與組織添加回收率結(jié)果(n=6)

2.3 消除規(guī)律研究

2.3.1 絨山羊給藥階段鹽酸克倫特羅在尿液中消除規(guī)律 A組給藥后24 h內(nèi)能在尿液中檢測到克倫特羅，而且濃度高達(dá)289 ng/mL。隨著給藥次數(shù)的增加，通過尿液排出的克倫特羅含量持續(xù)升高，直到給藥后第11天，達(dá)到第一次峰值，為5313 ng/mL，隨后尿液中克倫特羅濃度呈較平穩(wěn)的變化趨勢，直到給藥后第22天，尿液中克倫特羅濃度達(dá)到第二次峰值，為3825 ng/mL。B組給藥后24 h內(nèi)在尿液中檢測到克倫特羅，濃度高達(dá)1323 ng/mL，直到給藥后第9天，尿液中克倫特羅濃度達(dá)到第一次峰值，為11378 ng/mL，隨后尿液中克倫特羅濃度呈較平穩(wěn)的變化趨勢，直到給藥后第23天，尿液中克倫特羅濃度達(dá)到第二次峰值，為6890 ng/mL。A、B兩組代謝規(guī)律見圖9(n=8，RSD≤48.7%)，數(shù)據(jù)濃度偏差較大可能是由于絨山羊個體差異以及飼喂方式導(dǎo)致。

2.3.2 絨山羊停藥階段鹽酸克倫特羅在尿液中消除規(guī)律 停藥后尿液中殘留的克倫特羅濃度持續(xù)降低，降至第40天后A組尿液殘留濃度約9 μg/L，B組尿液殘留濃度約6 μg/L。出現(xiàn)A組尿液中部分克倫特羅殘留濃度大于B組，以及數(shù)據(jù)濃度偏差較大，可能是由于絨山羊個體差異以及飼喂方式導(dǎo)致。殘留趨勢線見圖10(n=3，RSD≤54.3%)。

圖9 飼喂階段羊尿液中克倫特羅含量(n=8)

圖10 停藥階段羊尿液中克倫特羅含量(n=3)

2.3.3 絨山羊停藥后鹽酸克倫特羅在組織中消除規(guī)律 停藥后第1天、第3天、第5天、第7天 、第10天、第15天 、第20天、第25天、第30天、第40天每組每個測試時間點隨機(jī)取3只宰殺，每只動物取上述4種組織樣品(肝臟、肺臟、腎臟、肌肉)。各組織殘留數(shù)據(jù)見表3。

表3 絨山羊停藥階段各組織中鹽酸克倫特羅殘留濃度

結(jié)果表明絨山羊肝臟、肌肉、肺臟、腎臟中均能檢測到克倫特羅殘留。不同組織中克倫特羅殘留濃度不同。停藥1 d，各組織中殘留濃度依次為肝臟＞腎臟＞肺臟＞肌肉。由于克倫特羅在不同的組織中消除速率不同，停藥第15天后，A組肝臟濃度下降了約8倍，腎臟濃度下降了約68倍，肺臟濃度下降了約26倍，肌肉濃度下降了約16倍;B組肝臟濃度下降了約12倍，腎臟濃度下降了約108倍，肺臟濃度下降了約41倍，肌肉濃度下降了約15倍，從而得出各組織消除速率為腎臟＞肺臟＞肌肉＞肝臟?？藗愄亓_在羊肝臟中消除最慢，在腎臟中消除最快。

3 結(jié)論

本試驗建立了專屬、靈敏的UPLC－MS/MS檢測方法，并研究了克倫特羅在絨山羊尿液及各組織中的消除規(guī)律。結(jié)果顯示，絨山羊的尿液、肝臟、肌肉、肺臟、腎臟中均能檢測到克倫特羅殘留，并在停藥后需較長時間消除。停藥后尿液中殘留的克倫特羅濃度持續(xù)降低，降至第40天后A組尿液殘留濃度約9 μg/L，B組尿液殘留濃度約6 μg/L。出現(xiàn)A組尿液中部分克倫特羅殘留濃度大于B組，可能是由于絨山羊個體差異以及飼喂方式導(dǎo)致。停藥40 d后，A、B兩組肝臟、腎臟均能檢測到克倫特羅殘留，肺臟和肌肉未檢出。

［1］ 方炳虎，陳杖榴，黃顯會.克倫特羅在豬體內(nèi)的生物利用度及藥物動力學(xué)研究［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報，1997，28(3):233 －237.

［2］ 張園園，吳永寧.克倫特羅的毒性作用及其中毒機(jī)制［J］.衛(wèi)生研究，2002，31(4):328－330.

［3］ 楊 靜.肉羊組織中鹽酸克倫特羅檢測方法及代謝殘留規(guī)律的研究［D］.北京:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2011.

［4］ 呂 燕，鮑偉華，余小華，等.GC－MS法研究豬體內(nèi)克侖特羅的殘留消除規(guī)律［J］.中國獸藥雜志，2009，43(11):26 －29.

［5］ 吳澤君，龍凌云，郭世明.高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法研究豬毛發(fā)中克侖特羅和萊克多巴胺的殘留及代謝規(guī)律［J］.中國獸藥雜志，2010，44(8):22 －26.

［6］ 農(nóng)業(yè)部1063號公告－3－2008.動物尿液中11種β—受體激動劑的檢測 液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法［S］.

［7］ 農(nóng)業(yè)部1025號公告－18－2008.動物源性食品中β－受體激動劑殘留檢測液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法［S］.