偽狂犬病毒單克隆抗體的制備和鑒定

李 建，曹 娟，廖園園，劉 潔，朱 微，秦 偉，秦紅剛，漆世華，謝紅玲

(武漢中博生物股份有限公司，武漢430070)

偽狂犬病(Pseudorabies，PR)是由偽狂犬病毒引起的豬、牛、羊等多種家畜、家禽及野生動物的一種重要的急性傳染病，又稱“Aujeszky 氏病”［1－2］。隨著養(yǎng)豬業(yè)的規(guī)?；图s化發(fā)展，該病給我國養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，因此，建立快速有效的診斷檢測方法對于控制和消滅PRV具有重要的意義。單克隆抗體技術(shù)是20世紀(jì)70年代生物學(xué)領(lǐng)域的重要成果之一。單克隆抗體具有純度高、重復(fù)性好、且能持續(xù)的無限量供應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)，對疾病的診斷治療以及疫苗的研究作出了巨大貢獻(xiàn)。目前，在獸醫(yī)臨床工作中，PRV的診斷方法多采用病毒分離、PCR技術(shù)和ELISA法。但是，這些方法不夠完善和深入，高準(zhǔn)確度、高靈敏度與快速、簡便并存的檢測方法目前還不成熟。為了更快速、更準(zhǔn)確的診斷疾病，以便對該病采取有效的防治措施，本試驗(yàn)利用PRV全病毒免疫小鼠后建立分泌抗PRV單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，為建立特異性強(qiáng)、敏感性高、簡便、快速的抗原捕獲ELISA診斷方法提供了條件。

1 材料與方法

1.1 毒株、細(xì)胞、實(shí)驗(yàn)動物和其他試劑 骨髓瘤細(xì)胞、PRV、豬睪丸細(xì)胞(ST)、豬細(xì)小病毒(PPV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)均為武漢中博生物股份有限公司保存;8周左右的雌性BALB/c購自武漢生物制品研究所。DMEM培養(yǎng)基(Hyclone公司)、次黃嘌呤氨基蝶呤胸腺嘧啶(HAT，Sigma公司)、次黃嘌呤胸腺嘧啶(HT，Sigma公司)、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記羊抗小鼠 IgG(Thermo公司)、異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記抗鼠IgG(Thermo公司)、單抗亞類鑒定試劑盒(洛陽賽爾維公司)、生物素標(biāo)記羊抗小鼠IgG和HRP標(biāo)記的鏈霉素(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.2 病毒增殖與純化 在ST細(xì)胞傳代后接種PRV，置37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，待75%以上細(xì)胞出現(xiàn)病變(CPE)后收毒，收獲后的病毒經(jīng)超濾濃縮，差速離心，蔗糖密度梯度離心［3］，電鏡檢測。

1.3 免疫 用純化的PRV與等量的弗氏完全佐劑充分乳化后，采用皮下多點(diǎn)免疫雌性BALB/c小鼠，分別間隔三周用減半劑量加弗氏不完全佐劑進(jìn)行二免和三免，融合前3 d腹腔加強(qiáng)注射。

1.4 間接ELISA篩選方法的建立 采用間接ELISA方法，按方陣法［4］確定包被PRV純化抗原濃度、HRP標(biāo)記抗體的最適工作濃度。以3，3’，5，5’－四甲基聯(lián)苯胺(TMB)為底物，測定OD450nm值。以陽性血清OD值在1.0左右，同時與陰性血清OD值差距最大的抗原包被濃度、抗體稀釋度為最佳工作濃度。

1.5 雜交瘤細(xì)胞株的建立 按常規(guī)方法［5］將免疫的小鼠脾臟細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞在50%聚乙二醇進(jìn)行融合，然后置HAT選擇性培養(yǎng)基，將其加入到鋪有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔板中進(jìn)行培養(yǎng)，間接ELISA和間接免疫熒光方法進(jìn)行篩選，有限稀釋法連續(xù)稀釋三次，陽性孔單克隆雜交瘤細(xì)胞連續(xù)傳代3個月。

1.6 腹水的生產(chǎn)及其純化 選12周齡左右的雌性BALB/c，腹腔注射雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行腹水的生產(chǎn)，采用辛酸－硫酸銨法純化腹水。

1.7 單克隆抗體的鑒定

1.7.1 單克隆抗體的效價 采用已經(jīng)建立的間接ELISA法測定細(xì)胞上清和腹水中單克隆抗體的效價。

1.7.2 單克隆抗體的亞類 用間接ELISA測定雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清中單克隆抗體的亞類。

1.7.3 雜交瘤細(xì)胞的染色體分析 按常規(guī)方法［6］對雜交瘤細(xì)胞的染色體進(jìn)行分析，于高倍顯微鏡下觀察，每份樣本應(yīng)計數(shù)100個中期完整的核細(xì)胞，記錄染色體數(shù)目的分布。

1.7.4 單克隆抗體的特異性鑒定

1.7.4.1 交叉反應(yīng) 以 PPV、PRRSV、PCV2 為包被抗原，用腹水分別與其進(jìn)行交叉檢測，用間接ELISA檢測OD450nm值。

1.7.4.2 間接免疫熒光法(IFA) 用PRV接種于含ST細(xì)胞的96孔板中，置37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后用－20℃丙酮固定。按方陣法［7］確定的腹水、FITC標(biāo)記的抗鼠IgG的工作濃度和反應(yīng)時間進(jìn)行IFA檢測，于熒光顯微鏡下觀察。

1.7.4.3 免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)(IHC) 組織玻片的制備經(jīng)取樣、固定、包埋、切片、固定。按方陣法［9］確定腹水、生物素標(biāo)記羊抗小鼠IgG和HRP標(biāo)記的鏈霉素最佳工作濃度和反應(yīng)時間進(jìn)行IHC檢測，經(jīng)3，3，二甲基聯(lián)苯胺(DAB)進(jìn)行底物顯色，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核之后，于顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.8 疊加實(shí)驗(yàn) 參照文獻(xiàn)方法［8－9］進(jìn)行疊加ELISA實(shí)驗(yàn)，并按其公式計算相加指數(shù)(AI)。

1.9 相對親和力的測定 方法參見文獻(xiàn)［10］。

1.10 單克隆抗體的穩(wěn)定性檢測 獲得的2個細(xì)胞株經(jīng)穩(wěn)定傳代后凍于液氮，1個月后復(fù)蘇，檢測細(xì)胞上清抗體。再經(jīng)腹腔注射BALB/c小鼠，同樣檢測腹水的抗體效價，并與凍存前效價進(jìn)行比較。

2 結(jié)果

2.1 病毒的增殖與純化 經(jīng)密度梯度離心之后總計獲得6 mg的PRV病毒，首次免疫劑量為每只100 μg/0.5 mL，電鏡結(jié)果見圖1。

圖1 PRV電鏡圖片(箭頭所指為PRV病毒粒子)

2.2 間接ELISA法工作條件的選擇 根據(jù)方陣法確定間接ELISA方法最佳的PRV包被濃度為0.5 μg/mL。經(jīng)間接 ELISA 法篩選，3次亞克隆共獲得2株分泌抗PRV的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為1E10和5B5。

2.3 腹水的生產(chǎn)及其純化 每只小鼠腹腔注射1.0×107個細(xì)胞，每只小鼠收取5 mL腹水，辛酸－硫酸銨法純化腹水，SDS－PAGE結(jié)果見圖2。

圖2 PRV單抗SDS-PAGE圖

2.4 單克隆抗體的鑒定

2.4.1 單克隆抗體的效價測定 1E10雜交瘤細(xì)胞上清的ELISA效價在1∶1000，腹水的ELISA抗體效價在1∶108，腹水的IFA效價1∶2000;5E5雜交瘤上清的ELISA效價在1∶500，腹水的ELISA抗體效價在1∶108，腹水的IFA效價1∶1500。

2.4.2 單克隆抗體的亞類測定 1E10亞類為IgG1，5B5 亞類為 IgG2b。

2.4.3 雜交瘤細(xì)胞的染色體分析 雜交瘤細(xì)胞的染色體在95～105范圍內(nèi)變化，平均值在98左右，該數(shù)值大于脾細(xì)胞染色體數(shù)的2倍，小于脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞染色體數(shù)目之和，表明該雜交瘤細(xì)胞確實(shí)為脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合的產(chǎn)物。

2.4.4 單克隆抗體的特異性鑒定

2.4.4.1 交叉反應(yīng) 間接ELISA檢測結(jié)果表明:PPV、PRRSV、PCV2均不與PRV腹水發(fā)生交叉反應(yīng)。

2.4.4.2 IFA 試驗(yàn) 腹水 1∶1000稀釋，F(xiàn)ITC 標(biāo)記的抗小鼠IgG 1∶100稀釋，2株單克隆抗體均能與ST細(xì)胞中的PRV發(fā)生反應(yīng)，可見接種了PRV的ST的細(xì)胞膜或胞漿中出現(xiàn)了綠色熒光(圖3)，陰性對照未見熒光。

圖3 PRV單抗免疫熒光圖片(400×)

2.4.4.3 IHC 試驗(yàn) 腹水1∶1000稀釋，HRP標(biāo)記羊抗小鼠IgG 1∶100稀釋，DAB顯色，2株單克隆抗體均能與神經(jīng)組織中的PRV發(fā)生反應(yīng)，可見感染了PRV的神經(jīng)組織的胞膜中出現(xiàn)棕黃色著染(圖4，400×)，陰性對照組織未見陽性反應(yīng)。

圖4 PRV單抗IHC陽性圖片(A)及陰性對照(B)

2.5 疊加實(shí)驗(yàn) 2株單抗疊加指數(shù)為85.27%，大于50%，說明2株單抗識別不同的抗原位點(diǎn)。

2.6 相對親和力實(shí)驗(yàn) 經(jīng)非競爭ELISA方法測定1E10的親和常數(shù)為7.4×109L/mol，5B5的親和常數(shù)為6.3 ×109L/mol。

2.7 雜交瘤細(xì)胞的穩(wěn)定性鑒定 2株雜交瘤細(xì)胞穩(wěn)定傳代后凍于液氮，1個月后復(fù)蘇，細(xì)胞生長狀態(tài)良好，抗體分泌水平與凍存前相同。腹腔接種BALB/c小鼠后可致瘤，并穩(wěn)定地分泌特異性抗體。

3 討論

本試驗(yàn)采用常規(guī)免疫方法制備單抗，雖然耗時較長，但是取得了比較好的免疫效果，制備出來的2株單抗顯示出了較好的特異性和穩(wěn)定性，在這個制備單克隆抗體的試驗(yàn)過程中，抗原質(zhì)量的好壞決定是否能夠順利篩選出單克隆雜交瘤細(xì)胞株，本試驗(yàn)采用了蔗糖密度梯度離心的方法純化偽狂犬病毒，取得了較好的效果。在篩選的過程中，本試驗(yàn)采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、免疫組織化學(xué)試驗(yàn)、間接免疫熒光試驗(yàn)三種檢測方法共同篩選雜交瘤細(xì)胞株，保證了結(jié)果的穩(wěn)定性和可靠性。試驗(yàn)還從雜交瘤細(xì)胞的染色體核型、經(jīng)過連續(xù)傳代培養(yǎng)和凍存復(fù)蘇之后的生物學(xué)特性、以及單克隆抗體的亞類、純度、效價、針對的表位等多方面，全方位考察了2株單克隆雜交瘤細(xì)胞株分泌抗體的能力強(qiáng)并且穩(wěn)定。

近年來，國內(nèi)外有很多 PRV單抗制備的報道［11－13］，但是抗原大多數(shù)是原核表達(dá)蛋白進(jìn)行免疫，篩選出來的單抗與天然病毒結(jié)合能力弱，沒有與其他豬病毒進(jìn)行交叉反應(yīng)，只識別同一抗原表位，本研究采用蔗糖密度梯度離心的方法純化PRV抗原，獲得了高純度的PRV，采用ELISA、IHC、IFA篩選與鑒定，同時與PPV、PRRSV、PCV2進(jìn)行了交叉反應(yīng)，結(jié)果證明所獲得的2株單抗不與 PPV、PRRSV、PCV2發(fā)生反應(yīng)，識別不同的抗原表位，本實(shí)驗(yàn)獲得的2株P(guān)RV單克隆抗體為建立特異性強(qiáng)、敏感性高、簡便、快速的PRV診斷方法提供了條件。

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