TBB通過WNT/β-catenin通路抑制甲狀腺濾泡狀癌細(xì)胞FTC133的增殖與遷移

王翠瑤，劉 超，任麗莉，張曉玉，孫 靜，肖建英

(遼寧醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室， 遼寧 錦州 121001)

研究論文

TBB通過WNT/β-catenin通路抑制甲狀腺濾泡狀癌細(xì)胞FTC133的增殖與遷移

王翠瑤，劉 超，任麗莉，張曉玉，孫 靜，肖建英*

(遼寧醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室， 遼寧 錦州 121001)

目的觀察四溴苯三唑(TBB)對甲狀腺濾泡狀癌細(xì)胞系FTC133的CK2α、β-catenin和SURVIVIN的mRNA和蛋白表達(dá)的影響，探討TBB抗甲狀腺癌的作用機(jī)制。方法體外培養(yǎng)FTC133細(xì)胞，分對照組(DMSO組)和TBB組(終濃度為12.5、25和50 μmol/L)，MTT法測定細(xì)胞增殖抑制率；劃痕實驗測定細(xì)胞遷移；RT-PCR和Western blot法分別檢測FTC133細(xì)胞CK2α、β-catenin和SURVIVIN的mRNA和蛋白表達(dá)。結(jié)果與對照組比較，TBB呈劑量依賴性抑制FTC133細(xì)胞的增殖和遷移。各TBB處理組CK2α mRNA表達(dá)水平明顯降低(Plt;0.01)；TBB組隨著濃度的逐漸加大，CK2α、β-catenin和SURVIVIN蛋白表達(dá)下降(Plt;0.01)。結(jié)論TBB在一定濃度范圍內(nèi)抑制甲狀腺濾泡狀癌細(xì)胞系FTC133的增殖和遷移，其機(jī)制可能與TBB下調(diào)CK2α表達(dá)進(jìn)而抑制WNT/β-catenin信號通路有關(guān)。

四溴苯三唑；甲狀腺濾泡狀癌；CK2α；β-catenin；SURVIVIN

蛋白激酶CK2是一種真核細(xì)胞中普遍存在和高度保守的信使非依賴性絲/蘇氨酸蛋白激酶，在細(xì)胞生長、轉(zhuǎn)化、生存、增殖、凋亡和腫瘤發(fā)生過程中都發(fā)揮重要作用[1- 2]。CK2 是由催化亞基α、α′和調(diào)節(jié)亞基 β組成的四聚體，其中蛋白激酶CK2α具有癌基因作用，它的磷酸化底物可能涉及到許多蛋白的調(diào)節(jié)[3- 4]。研究報道，過表達(dá)CK2α增強(qiáng)β-catenin的轉(zhuǎn)錄活性和SURVIVIN的蛋白表達(dá)，并抑制HEK- 293T細(xì)胞凋亡[5]。但CK2α、β-catenin和SURVIVIN在甲狀腺癌細(xì)胞中的表達(dá)尚未見報道。高選擇性膜通透CK2抑制劑四溴苯三唑(4,5,6,7-tetrabromobenzotriazole，TBB)具有抗腫瘤作用，它可能成為腫瘤治療的重要靶藥物[6]，但TBB對甲狀腺癌的作用機(jī)制尚不清楚。本研究通過選用不同濃度TBB作用甲狀腺濾泡狀癌細(xì)胞系FTC133，旨在探討TBB對人甲狀腺癌細(xì)胞CK2α、β-catenin和SURVIVIN的影響，為TBB的臨床開發(fā)應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

TBB[T0826-10MG,≥98% (HPLC)，Sigma公司]；DMEM/F12培養(yǎng)液(11330-032-500 mL，Gibco公司)；胎牛血清(PAA公司)；CK2α(C-18)(sc-6479)、β-catenin(C-18)(sc-1496)、SURVIVIN(C-19)抗體(sc-8807)和β-actin抗體(sc-130656)(Santacruz公司)；HRP標(biāo)記的山羊抗兔和兔抗山羊IgG(ZB-2301和ZB-2306，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(32109，Piece Biotechnology公司)；RNA PCR Kit (AMV)Ver.3.0試劑盒(DRR019A，Takara公司)；MTT、Western細(xì)胞裂解液和BCA蛋白濃度測定試劑盒(北京碧云天生物技術(shù)公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及實驗分組

低分化濾泡狀甲狀腺癌細(xì)胞系FTC133(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科王輝教授惠贈)培養(yǎng)基為DMEM/F12，含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL的鏈霉素，在飽和濕度、37 ℃和無CO2孵箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞處于對數(shù)期時，以合適濃度接種于培養(yǎng)板或培養(yǎng)瓶，待細(xì)胞貼壁后給藥，TBB組終濃度分別為0、12.5、25和50 μmol/mL，對照組加入5 μL DMSO [DMSO濃度小于0.1%(V/V)，此濃度對細(xì)胞生長無影響]。

1.3 MTT法測定細(xì)胞增殖抑制率

取96孔板中對數(shù)生長期FTC133細(xì)胞，棄去上清液，實驗組分別加不同濃度TBB，對照組加入等體積DMSO的培養(yǎng)基，空白組加入等體積的培養(yǎng)基，各濃度組6個復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)12、24和48 h后，20 μL MTT(5 g/L)孵育4 h。棄去培養(yǎng)液，加入150 μL二甲基亞砜，振蕩15 min，使沉淀物充分溶解。酶聯(lián)免疫檢測儀測定各孔吸光度值，計算各時間點細(xì)胞增殖抑制率。每組實驗重復(fù)3次。

1.4 劃痕實驗測定細(xì)胞遷移能力

將生長至匯合度達(dá)90%的FTC133細(xì)胞，用黃槍頭劃痕，PBS清洗3次，利用倒置顯微鏡標(biāo)尺，測量劃痕寬度；細(xì)胞加TBB處理后不同時間點(0、6、12、24和48 h)監(jiān)測劃痕寬度變化，并照相。

1.5RT-PCR方法檢測CK2α、β-catenin及SURVIVIN的mRNA表達(dá)水平

Trizol法提取各組細(xì)胞總RNA并測定RNA濃度。按照TaKaRa RNA PCR(AMV)Ver3.0試劑盒的操作步驟進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和PCR。反轉(zhuǎn)錄條件42 ℃，30 min；99 ℃，5 min；5 ℃，5 min。PCR引物序列CK2α(5′-CCGAGTTGCTTCCCGATAC-3′，5′-GGGC TGACAAGGTGCTG AT-3′，315 bp)；β-catenin(5′-CGGTACATGCATGACTGAGAC-3 ′，5′-GTCACGTGG TACGACGTCAGAT-3′ 310 bp)；SURVIVIN(5′-CC AAGGTCTGGCTCGTTCTCATG-3′，5′-GCGCACTTTC TCCGCAGTTTC-3′，357 bp)；β-actin(5′-TGACGGGG TCACCCACACTGTGCCCATCTA-3′，5′-CTAGAAGC ATTTGCGGTGGACGATGGAGGG-3′，661 bp)。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃ 30 s；X ℃(CK2α 52.2 ℃、β-catenin 60 ℃、SURVIVIN 62 ℃) 30 s；72 ℃ 1 min；30個循環(huán)；72 ℃終延伸7min。取PCR產(chǎn)物10 μL進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳并拍照，并測量吸光度，mRNA表達(dá)水平以每一樣品與β-actin吸光度比值表示。

1.6Westernblot方法檢測CK2α、β-catenin和SURVIVIN的蛋白表達(dá)

用蛋白裂解液提取對數(shù)生長期細(xì)胞總蛋白并測定蛋白濃度。電泳前加入2×SDS樣品緩沖液，100 ℃煮沸5 min，離心后上樣，10%SDS-PAGE電泳分離，將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，用含5% 牛血清白蛋白的TBS(pH 7.4)將濾膜室溫?fù)u動2 h，封閉后的濾膜再分別與CK2α、β-catenin和SURVIVIN抗體(稀釋比為1∶200) 及β-actin(稀釋比為1∶1 000)4 ℃溫育過夜。經(jīng)TTBS洗滌后，HRP偶聯(lián)的IgG作為二抗(稀釋比為1∶ 000)室溫溫育2 h后洗膜，ECL發(fā)光法顯色。Image J分析密度，計算吸光度值，內(nèi)參采用β-actin。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞增殖抑制率的變化

12.5、25和50 μmol/L TBB分別作用FTC133細(xì)胞12、24和48 h后，各組細(xì)胞增殖率隨著時間和藥物濃度的升高而降低(Plt;0.01) (表1)。

2.2 TBB對FTC133細(xì)胞遷移的影響

對照組(DMSO)和TBB組FTC133細(xì)胞于12 h后開始遷移，24和48 h后TBB組細(xì)胞遷移的數(shù)量較對照組少，距離相對較遠(yuǎn)。且隨著TBB濃度的增加，遷移距離明顯增加，24和48 h后遷移距離差異明顯(Plt;0.01)(圖1)。

表1 TBB(0、12.5、25和50 μmol/L)抑制FTC133細(xì)胞增殖

*Plt;0.01 compared with control group.

2.3CK2α、β-catenin和SURVIVINmRNA表達(dá)水平

與對照組比較，各劑量TBB作用FTC133細(xì)胞后CK2α mRNA表達(dá)降低，且隨劑量增加表達(dá)越低(Plt;0.01)(圖2，表2)。

圖1 TBB抑制FTC133細(xì)胞的遷移

A.CK2α mRNA expression levels; B.β-catenin mRNA expression levels; C.SURVIVIN mRNA expression levels; M.marker; 1.DMSO; 2.12.5 μmol/L; 3.25 μmol/L; 4.50 μmol/L

圖2 FTC133細(xì)胞中CK2α、β-catenin和SURVIVIN mRNA表達(dá)水平Fig 2 The CK2α, β-catenin and SURVIVIN mRNA expression levels in FTC133 cells

*Plt;0.01 compared with control group.

2.4CK2α、β-catenin和SURVIVIN蛋白表達(dá)水平

與對照組比較，各劑量TBB作用后細(xì)胞中CK2α、β-catenin和SURVIVIN的蛋白表達(dá)明顯降低(Plt;0.01)，且隨劑量增加表達(dá)越低(圖3，表3)。

M.marker; 1.DMSO; 2.12.5 μmol/L;3.25 μmol/L;4.50 μmol/L圖3 FTC133細(xì)胞經(jīng)TBB(0、12.5、25和50 μmol/L)處理后CK2α、β-catenin和SURVIVIN的蛋白表達(dá)Fig 3 The CK2α, β-catenin and SURVIVIN proteinexpression levels in FTC133 cells

groupCK2α/β-actinβ-catenin/β-actinSURVIVIN/β-actincontrol0.912±0.0150.539±0.0180.377±0.020 12.50.392±0.021*0.431±0.023*0.341±0.032*TBB(μmol/L) 250.313±0.013*0.309±0.013*0.295±0.021* 500.202±0.026*0.145±0.020*0.135±0.013*

*Plt;0.01 compared with control group.

3 討論

蛋白激酶CK2廣泛表達(dá)于各種組織的真核細(xì)胞中，為細(xì)胞生長、增殖、分化所不可或缺的關(guān)鍵因子之一。TBB是ATP結(jié)合位點的競爭性抑制劑，是磷酸供體底物類似物，應(yīng)用廣泛[6]，但對甲狀腺癌的作用知之甚少。本實驗首先用不同濃度TBB作用甲狀腺濾泡狀癌細(xì)胞系FTC133，MTT法表明TBB顯著抑制FTC133細(xì)胞的增殖，并呈明顯的劑量依賴效應(yīng)，這與我們之前的實驗結(jié)果相吻合[7]。劃痕愈合實驗也表明TBB隨著濃度的增加顯著抑制FTC133細(xì)胞遷移。研究表明，CK2是哺乳動物細(xì)胞中WNT信號通路的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，主要通過WNT信號導(dǎo)致β-catenin入核后與轉(zhuǎn)錄因子TCF結(jié)合，形成TCF/β-catenin復(fù)合體，直接激活下游基因C-MYC、CYCLIN D1和SURVIVIN的轉(zhuǎn)錄，介導(dǎo)細(xì)胞的生長、增殖和分化，參與惡性腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展[8- 9]。為探討TBB抑制FTC133細(xì)胞增殖和遷移的可能機(jī)制，我們觀察了經(jīng)TBB處理后WNT信號通路中的重要成員β-catenin及下游的生長凋亡抑制因子SURVIVIN的表達(dá)情況。不同濃度TBB處理FTC133細(xì)胞后，明顯下調(diào)CK2α的mRNA和蛋白水平，并隨著濃度的增加，抑制作用明顯增強(qiáng)，說明TBB能明顯抑制CK2α的表達(dá)。經(jīng)TBB處理后FTC133細(xì)胞β-catenin和SURVIVIN的mRNA水平不變化，而蛋白水平降低，說明TBB對β-catenin和SURVIVIN的調(diào)節(jié)可能發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后、翻譯或翻譯后水平。結(jié)合本實驗室的前期工作[7]，TBB可能通過WNT/β-catenin信號通路抑制甲狀腺濾泡狀癌FTC133細(xì)胞增殖與遷移，但激活CK2α的表達(dá)是否通過WNT/β-catenin信號通路發(fā)揮作用，本實驗室仍在進(jìn)一步研究之中。

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TBB inhibits the proliferation and migration of thyroidpapillary carcinoma cell line FTC133 via WNT/β-catenin signaling pathway

WANG Cui-yao, LIU Chao, REN Li-li, ZHANG Xiao-yu, SUN Jing, XIAO Jian-ying*

(Dept. of Biochemistry and Molecular Biology, Liaoning Medical University, Jinzhou 121001, China)

ObjectiveTo observe the effects of 4,5,6,7-tetrabromobenzotriazole(TBB) on the expressions of CK2α，β-catenin and SURVIVIN in thyroid papillary carcinoma cell line FTC133 and to explore the possible underlying mechanism.MethodsFTC133 cells were culturedinvitroand divided into control group(DMSO), TBBgroups(12.5, 25, 50 μmol/L)randomly. The proliferation rate and migration of FTC133 cells was detected by MTT and wound healing method. The CK2α, β-catenin and SURVIVIN mRNA and protein expression levels were determined by RT-PCR and Western blot.ResultsCompared with control group, the proliferation rate and migration of FTC133 cells were inhibited by TBB in a dose-dependent manner(Plt;0.01).The expression levels of mRNA and protein of CK2α were significantly decreased in the presence of different TBB in FTC133 cells(Plt;0.01), the protein expression level of β-catenin and SURVIVIN was also decreased(Plt;0.01).ConclusionsTBB inhibits the proliferation and migration of thyroid papillary carcinoma cell line FTC133 via WNT/β-catenin signaling pathway.

TBB；thyroid papillary carcinoma；CK2α；β-catenin；SURVIVIN

2014- 02- 21

2014- 05- 27

遼寧省科學(xué)技術(shù)計劃(2013225305)

*通信作者(correspondingauthor)：lyxiaojy@163.com

1001-6325(2014)10-1381-05

R 581.3

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