COX多因素分析和ROC曲線綜合評價(jià)DNA修復(fù)基因?qū)Ρ茄拾┑念A(yù)后價(jià)值

楊 姣，蒿艷蓉，馮國生，陳甲信，鄧 珊，龐 強(qiáng)，秦 儉

(廣西壯族自治區(qū) 人民醫(yī)院 臨床腫瘤中心，廣西 南寧 530021)

研究論文

COX多因素分析和ROC曲線綜合評價(jià)DNA修復(fù)基因?qū)Ρ茄拾┑念A(yù)后價(jià)值

楊 姣，蒿艷蓉*，馮國生，陳甲信，鄧 珊，龐 強(qiáng)，秦 儉

(廣西壯族自治區(qū) 人民醫(yī)院 臨床腫瘤中心，廣西 南寧 530021)

目的應(yīng)用COX多因素分析和ROC曲線探討DNA修復(fù)基因?qū)Ρ茄拾┑念A(yù)后價(jià)值。方法收集2007年5月至2012年2月經(jīng)廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院病理科確診為鼻咽癌且選擇調(diào)強(qiáng)放射治療的患者100例。篩選隨訪時(shí)間超過1年的患者共71例，用免疫組化SP法檢測鼻咽癌組織中DNA修復(fù)基因DNA-PKcs及BRCA1的表達(dá)。用Spearman分析DNA-PKcs和BRCA1的表達(dá)水平與臨床特征的相關(guān)性；ROC曲線法建立預(yù)后分組，用Kaplan-Meier生存曲線對DNA-PKcs、BRCA1的表達(dá)與預(yù)后關(guān)系進(jìn)行單因素分析；Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸對預(yù)后進(jìn)行多因素生存分析。結(jié)果1)DNA-PKcs的表達(dá)水平和患者的生存時(shí)間呈正相關(guān)(Plt;0.05)。2)DNA-PKcs高表達(dá)患者的生存時(shí)間長于低表達(dá)的患者(Plt;0.01)。3)多因素生存分析，DNA-PKcs表達(dá)水平是影響預(yù)后的獨(dú)立因素(Plt;0.01)，而BRCA1表達(dá)水平未能得出類似結(jié)果。結(jié)論DNA-PKcs表達(dá)狀態(tài)是影響預(yù)后的獨(dú)立因素。DNA-PKcs高表達(dá)可能作為預(yù)測鼻咽癌患者預(yù)后較好的一個(gè)指標(biāo)。

鼻咽癌；COX多因素分析；ROC曲線；DNA修復(fù)基因；預(yù)后

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma)是我國常見的惡性腫瘤之一，好發(fā)于中國南方各省，世界上80% 的鼻咽癌發(fā)生在中國，鼻咽癌發(fā)病率居頭頸部腫瘤的首位，發(fā)病年齡以30～50歲最為多見[1]。放射治療是鼻咽癌的主要治療手段，放射線通過其生物學(xué)效應(yīng)作用于受照射細(xì)胞的遺傳物質(zhì)，導(dǎo)致細(xì)胞無法修復(fù)而死亡。但其中一些沒有死亡但又無法完全修復(fù)的DNA末端可能參與染色體轉(zhuǎn)錄過程中的某些位點(diǎn)從而影響基因的穩(wěn)定性[2]。本研究通過檢測DNA修復(fù)基因DNA-PKcs、BRCA1在鼻咽癌組織中的表達(dá)水平并結(jié)合臨床資料，利用COX多因素分析和ROC曲線綜合評價(jià)DNA修復(fù)基因?qū)Ρ茄拾┑念A(yù)后價(jià)值，以期為患者的個(gè)體化治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑

DNA-PKcs和BRCA1兔抗人單克隆抗體濃縮型、SP免疫組化檢測試劑盒(兔)(北京博奧森公司)。

1.2 臨床資料

1.2.1 病例資料：本研究收集2007年5月至2012年2月經(jīng)廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院臨床腫瘤中心確診入院并采取調(diào)強(qiáng)放射治療的鼻咽癌患者100例。入組標(biāo)準(zhǔn)：1)經(jīng)病理檢查證實(shí)為鼻咽癌且尚未進(jìn)行任何腫瘤?？浦委煹某踔位颊撸_診病例均有保存完好的鼻咽癌石蠟病理標(biāo)本；2) 按照鼻咽癌 (AJCC sixth Edition 2002)分期為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳa及Ⅳb期的患者；3)所有患者治療前均經(jīng)鼻咽+顱底+頸部MRI平掃+增強(qiáng)的檢查證實(shí)具有可測量的腫瘤病灶且無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；4)年齡17～76歲，PS評分≤2分；治療前血常規(guī)、肝、腎功能及心電圖各項(xiàng)指標(biāo)均無異常；5)無合并癥及放化療禁忌者，無其他腫瘤病史；6)所有患者均簽署知情同意書。所有標(biāo)本均由10% 中性甲醛固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋。采用免疫組織化學(xué)SP法染色。從患者出院后開始定期隨訪，隨訪日期截至2012年10月，中位隨訪31月，100例患者隨訪超過12月者71例。71例患者的臨床資料見表1。

表1 71例鼻咽癌患者臨床特征分布表

WHO.World Health Organization; AJCC.American Joint Committee on Cancer.

1.2.2 治療方法：Ⅰ和Ⅱ期患者接受單純根治性調(diào)強(qiáng)放射治療(intensity modulated radiation therapy，IMRT)。Ⅲ期、Ⅳa和Ⅳb期患者接受鉑類為主同步放化療。具體IMRT方案：所有患者均采用仰臥位、熱塑面罩固定頭頸肩部，以層厚2 mm行CT增強(qiáng)掃描定位，數(shù)據(jù)重建后傳入CMS或Pinnacle計(jì)劃系統(tǒng)。勾畫靶區(qū)包括：大體腫瘤體積(gross tumor volume，GTV)，臨床靶區(qū)(clinical target volume，CTV)、計(jì)劃靶區(qū) (planning target volume，PTV)及危及器官，制定IMRT計(jì)劃，鼻咽大體腫瘤體積(GTV-nx)處方劑量68～72 Gy/30～32 f；頸部轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)(GTV-nd)處方劑量68～72 Gy/30～32 f；臨床靶體積1(CTV1)58～62 Gy/30～32 f；臨床靶體積2(CTV2)50～6 Gy/30～32 f。 計(jì)劃驗(yàn)證合適后進(jìn)行治療。所有患者均接收根治性IMRT?；煼桨福篋DP 40 mg/m2，1次/周，放療期間同步應(yīng)用6～7周，放療第1天同步開始。

1.2.3 療效評價(jià)方法：完成調(diào)強(qiáng)放射治療或者同步放化療后1個(gè)月，經(jīng)鼻咽+顱底+頸部 MRI平掃+增強(qiáng)復(fù)查與治療前MRI對比，原發(fā)灶退縮的近期療效評價(jià)參照國際上通用實(shí)體瘤的療效評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)(response evaluation criteria in solid tumors，RECIST)。

1.3 病理實(shí)驗(yàn)

1.3.1 病理標(biāo)本：選取上述病例中隨訪超過12個(gè)月且首診在廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院患者的鼻咽癌組織病例標(biāo)本共71例。

1.3.2 方法：采用免疫組織化學(xué)S-P法。免疫組化結(jié)果評定：DNA-PKcs和BRCA1陽性物質(zhì)表達(dá)定位于細(xì)胞系。由有經(jīng)驗(yàn)的病理科主治醫(yī)師在不知道任何臨床和病理資料的情況下，通過光學(xué)顯微鏡，每張切片選5個(gè)高倍視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，觀察腫瘤細(xì)胞免疫組化染色的情況并進(jìn)行評分。根據(jù)陽性細(xì)胞百分比進(jìn)行分組，陽性細(xì)胞計(jì)數(shù) ≥50%定義為BRCA1高表達(dá)組；陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)lt;50%及不表達(dá)者分別定義為BRCA1低表達(dá)組。統(tǒng)計(jì)分析時(shí)記(-)為低表達(dá)，(+)為高表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)數(shù)資料應(yīng)用Spearman進(jìn)行相關(guān)性分析，單向無序計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。ROC曲線法建立預(yù)后分組，應(yīng)用Kaplan-Meier生存曲線對DNA-PKcs、BRCA1的表達(dá)水平與預(yù)后關(guān)系進(jìn)行單因素分析，log-rank檢驗(yàn)分析生存曲線的差異；以Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型對預(yù)后進(jìn)行多因素生存分析。

2 結(jié)果

2.1鼻咽癌組織中DNA修復(fù)基因免疫組化表達(dá)情況

71例鼻咽癌患者中DNA-PKcs高表達(dá)45例(59.2%)，低表達(dá)26例(40.8%)；BRCA1高表達(dá)31例(42.2%)，低表達(dá)40例(57.8%)(表2；圖1，2)。

表2 DNA-PKcs和BRCA1在鼻咽癌組織中表達(dá)情況

A.immunostaining for DNA-PKcs; B.BRCA1 in representative cases from the high DNA-PKcs groups and high BRCA1 groups; note the strong immunoreactivity predominantly in the nuclei of the tumor cells, magnification times

圖1DNA-PKcs和BRCA1免疫組化結(jié)果
Fig1ImmunohistochemicalresultsofDNA-PKcsandBRCA1(×400)

圖2 ROC曲線法建立患者預(yù)后分組示意圖Fig 2 Using ROC curve to establish the prognosisof patients

2.271例DNA-PKcs與BRCA1蛋白表達(dá)與臨床因素的相關(guān)性

2.2.1 DNA-PKcs、BRCA1表達(dá)情況與患者臨床特征相關(guān)性分析：DNA-PKcs與BRCA1表達(dá)情況與患者的年齡、性別、病理分型、T分期、AJCC分期及近期療效均無相關(guān)性(表3)。

2.2.2 根據(jù)ROC曲線法建立預(yù)后分組：根據(jù)ROC曲線把患者生存時(shí)間超過及等于32個(gè)月定義為預(yù)后較好組，生存時(shí)間小于32個(gè)月定義為預(yù)后較差組(Plt;0.05，圖2)，根據(jù)ROC曲線分組，DNA-PKcs的表達(dá)水平和患者的生存時(shí)間呈正相關(guān)(Plt;0.05)(表4)。

2.2.3 DNA-PKcs、BRCA1表達(dá)水平與預(yù)后單因素分析： 應(yīng)用Kaplan-Meier生存曲線對DNA-PKcs、BRCA1表達(dá)水平與預(yù)后關(guān)系進(jìn)行單因素分析，結(jié)果提示高表達(dá)患者的生存時(shí)間長于低表達(dá)的患者(Plt;0.01)(圖3)，不同BRCA1表達(dá)水平與患者生存時(shí)間關(guān)系無明顯相關(guān)性(圖4)。DNA-PKcs和BRCA1共同高表達(dá)組患者與非共同高表達(dá)組患者的生存曲線無明顯相關(guān)性，但共同高表達(dá)組患者顯示出生存時(shí)間更長的這種趨勢(P=0.057)(圖5)。

2.2.4 DNA-PKcs、BRCA1表達(dá)水平與預(yù)后多因素分析：應(yīng)用Cox模型對預(yù)后進(jìn)行多因素生存分析，結(jié)果顯示DNA-PKcs表達(dá)水平是影響預(yù)后的獨(dú)立因素，而BRCA1表達(dá)水平未能得出類似結(jié)果(表5)。

3 討論

本研究首次報(bào)道了DNA修復(fù)基因DNA-PKcs和BRCA1在蛋白水平的表達(dá)情況和鼻咽癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的關(guān)系。通過單因素分析觀察到：在鼻咽癌患者中，低表達(dá)DNA-PKcs者較高表達(dá)DNA-PKcs者更容易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(圖3)。DNA依賴蛋白激酶(DNA-dependent Protein kinas，DNA-PK)，由3個(gè)亞基組成：Ku70、 Ku80以及DNA-PKcs，其中Ku70、 Ku80組成的二聚體是DNA-PK調(diào)節(jié)亞基， DNA-PKcs是DNA-PK催化亞基[3]。應(yīng)用多因素分析最終得出DNA-PKcs高表達(dá)患者預(yù)后更好(表5)。但本課題假設(shè)的是：DNA-PKcs高表達(dá)患者應(yīng)該具有更好的DNA修復(fù)能力，更容易產(chǎn)生放療抵抗，最終導(dǎo)致預(yù)后更差。本研究結(jié)果顯示,DNA-PKcs高表達(dá)者預(yù)后更好，這可能是因?yàn)镈NA修復(fù)基因DNA-PKcs和BRCA1在維持基因穩(wěn)定性方面也起著重要的作用[4]，DNA修復(fù)基因高表達(dá)提示修復(fù)損傷的DNA能力較強(qiáng)，低表達(dá)則提示修復(fù)損傷的DNA能力較弱，未能修復(fù)的DNA末端可能參與染色體的轉(zhuǎn)錄過程中的某些位點(diǎn)從而影響基因的穩(wěn)定性[5]， 這種不可逆的損傷最終導(dǎo)致患者預(yù)后較差。同時(shí)DNA-PKcs的修復(fù)能力還與P53的表達(dá)水平密切相關(guān)，P53低表達(dá)但DNA-PKcs高表達(dá)者預(yù)后較好，P53高表達(dá)但DNA-PKcs低表達(dá)者預(yù)后較差[6]。不過產(chǎn)生這種現(xiàn)象的內(nèi)在機(jī)制目前還不知道。再者，DNA-PKcs修復(fù)能力還受DNA-PK的活性調(diào)控，DNA-PK活性降低將會影響DNA修復(fù)能力，最終導(dǎo)致基因的不穩(wěn)定以及染色體不可逆的損傷以及更高的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移發(fā)生率[7]。本研究得到和文獻(xiàn)[8]相似的結(jié)果，其在胃癌中的研究表明，DNA-PKcs低表達(dá)患者，腫瘤進(jìn)展快且預(yù)后較差。乳腺癌基因BRCA1(breast cancer gene 1) 最早被確定是在1990年[9]。本實(shí)驗(yàn)，沒有觀察到BRCA1的表達(dá)水平和臨床結(jié)果的相關(guān)性(表4)。目前BRCA1在乳腺癌中的研究較多，但BRCA1的表達(dá)水平與乳腺癌的預(yù)后的關(guān)系尚未十分明確，BRCA1的表達(dá)水平與乳腺癌預(yù)后有關(guān)[10]，BRCA1的表達(dá)水平與乳腺癌預(yù)后無關(guān)[11]。BRCA1蛋白參與許多不同而且復(fù)雜的細(xì)胞程序，而染色體對不同的誘變劑的敏感性不一樣。因此，BRCA1的不同突變在DNA損傷的識別和處理上都會有不同。BRCA1在鼻咽癌中尚無相關(guān)研究，BRCA1與鼻咽癌患者預(yù)后的關(guān)系還需要繼續(xù)研究。

表3 DNA-PKcs與BRCA1蛋白表達(dá)與臨床因素的相關(guān)性

CR.complete response; Non-CR.non-complete response.

表4 DNA-PKcs及BRCA1表達(dá)水平與患者生存時(shí)間分析

*P﹤0.05 compared with DNA-PKcs(-).

圖3 DNA-PKcs不同表達(dá)水平的鼻咽癌患者生存曲線Fig 3 Survival curves of different DNA-PKcs expressionlevels in patients with nasopharyngeal carcinoma

圖4 BRCA1不同表達(dá)水平的鼻咽癌患者生存曲線Fig 4 Survival curves of different BRCA1 expressionlevels in patients with nasopharyngeal carcinoma

The upper and lower arm represent patients with overexpression of DNA-PKcs(+) and BRCA1(+)and the non-overexpression of them, respectively; the lower curves includes DNA-PKcs(+) /BRCA1(-), DNA-PKcs(-) /BRCA1(+) and DNA-PKcs(-) /BRCA1(-)圖5 DNA-PKcs和BRCA1共同高表達(dá)組患者與非共同高表達(dá)組患者的生存曲線Fig 5 Survival curves in patients with nasopharyngealcarcinoma

表5 應(yīng)用Cox模型對無轉(zhuǎn)移生存率進(jìn)行多因素生存分析Table 5 Using the Cox model for multi-factor survival analysis metastasis-free survival

總之，DNA-PKcs高表達(dá)患者的生存時(shí)間明顯長于DNA-PKcs低表達(dá)患者，DNA-PKcs的表達(dá)水平可以作為預(yù)測鼻咽癌患者預(yù)后的一個(gè)生物指標(biāo)。BRCA1暫未見BRCA1在鼻咽癌中的研究，BRCA1與鼻咽癌患者預(yù)后的關(guān)系還需要繼續(xù)研究。

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Combinating COX multivariate analysis with ROC curve to evaluatethe prognostic value of DNA repair gene in nasopharyneal carcinoma

YANG Jiao, HAO Yan-rong*, FENG Guo-sheng, CHEN Jia-xin, DENG Shan, PANG Qiang, QIN Jian

(Dept. of Chemotherapy, Clinical Cancer Center, People’s Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region, Nanning 530021, China)

ObjectiveUsing COX multivariate analysis and ROC curve to evaluate the prognostic value of DNA repair gene in patients with nasopharyngeal carcinoma.MethodsFrom May 2007 to February 2012, all 100 untreated patients with NPC, who were planned to receive IMRT at the People’s Hospital of Guangxi Autonomous Region were enrolled into this study. Screening for more than 1 year follow-up of 71 cases, formalin-fixed tumor biopsy specimens from 71 untreated patients with NPC were analyzed by immunohistochemical methods. Spearman’s analysis was put into use in the correlation ofDNA-PKcsandBRCA1 expression level and clinical characteristics. Kaplan-Meier survival curves analyzed the relationship between expression ofDNA-PKcsandBRCA1 and prognostic groups which were established by ROC curves. And Cox proportional hazards regression multi-factor survival analysis was carried out on the prognosis at last.Results1)There was a significant positive correlation between the expression level of DNA-PKcs and survival time of patients (Plt;0.05). 2)Moreover, patients with high DNA-PKcs

expression survived longer than patients with low level of DNA-PKcs(Plt;0.01). 3) On multivariate analysis, only DNA-PKcs expression level was an independent prognostic factor(Plt;0.01). No significant association was found between the level ofBRCA1 expression and the clinical outcome.ConclusionsDNA-PKcs expression level is an independent factor in prognostic and the patients with high level had a longer survival.

nasopharyngeal carcinoma; COX multivariate analysis; ROC curve; DNA repair genes; prognosis

2013- 12- 27

2014- 04- 29

國家自然科學(xué)基金(81260348)；廣西衛(wèi)生廳重點(diǎn)項(xiàng)目(桂衛(wèi)重2010037)

*通信作者(correspondingauthor)：yanronghao.2008@aliyun.com

1001-6325(2014)10-1333-06

R 739.62

A