• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    替米沙坦抑制大鼠非酒精性脂肪肝纖維化

    2014-11-27 11:57:41金愛花李成浩金海燕
    基礎(chǔ)醫(yī)學與臨床 2014年10期
    關(guān)鍵詞:米沙坦膠原酒精性

    李 欣,金愛花,黃 媛,李成浩,金海燕

    (延邊大學 附屬醫(yī)院 消化內(nèi)科,吉林 延吉 133000)

    研究論文

    替米沙坦抑制大鼠非酒精性脂肪肝纖維化

    李 欣,金愛花,黃 媛,李成浩,金海燕*

    (延邊大學 附屬醫(yī)院 消化內(nèi)科,吉林 延吉 133000)

    目的探討替米沙坦(Tel)對大鼠非酒精性脂肪肝纖維化(NAFLF)的抑制作用。方法60只Wistar大鼠隨機均分為6個組,對照組用含膽堿的氨基酸(CSAA)飼料喂養(yǎng),添加0(CSAA組)或2.5 mg/(kg BW)(CDAA治療組)的Tel;剩余4組用膽堿缺乏的氨基酸(CDAA)飼料喂養(yǎng)復制非酒精性脂肪肝纖維化模型,分別添加0 (CDAA組)、0.5 (低)、1.0 (中)和2.5 mg/(kg BW) (高濃度組)的Tel,共10周。常規(guī)方法檢測血清生化指標。免疫組化法觀察肝組織α-平滑肌激動蛋白(α-SMA)和轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)的表達;實時定量PCR法測定肝組織Ⅰ型前膠原、金屬基質(zhì)蛋白酶(MMPs)及其抑制物(TIMPs)的表達。結(jié)果CDAA組血漿中透明質(zhì)酸,堿性磷酸酶,γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶和總膽紅素均高于CDAA添加Tel組(Plt;0.05 或Plt;0.01);肝組織α-SMA 和TGFβ1定量分析表明,CDAA組表達明顯高于CDAA添加Tel組(均Plt;0.01)。CDAA組的Ⅰ型前膠原表達明顯高于CDAA添加Tel組(Plt;0.01),且隨著Tel劑量的增加,表達逐漸減少;同時MMP- 13表達上升(Plt;0.01),而MMP- 2及9和TIMP- 1及2的表達下降(Plt;0.01);Tel控制CDAA喂養(yǎng)大鼠的體質(zhì)量增加。結(jié)論替米沙坦可通過抑制肝星狀細胞的活化而阻止NAFLF的形成,有望成為控制非酒精性脂肪肝病發(fā)展的很有前景的藥物。

    替米沙坦;肝纖維化;肝星狀細胞;非酒精性脂肪肝病

    目前,非酒精性脂肪肝病(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)在發(fā)達國家已成為慢性肝病的主要病因,做為一種進展性與代謝相關(guān)的肝病,包括了單純性脂肪肝、非酒精性脂肪肝炎(non-alcoholic steatohepatitis, NASH)、非酒精性脂肪肝纖維化(non-alcoholic fatty liver fibrosis, NAFLF)、肝硬化和肝癌[1- 2]。腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system, RAS)在肝纖維化發(fā)展中起重要作用, 其中血管緊張素Ⅱ是主要作用因子[3],它可作用于血管緊張素Ⅱ的Ⅰ型受體(angiotensinⅡ type 1 receptor, AT1)而發(fā)揮作用。眾所周知,肝星狀細胞(hepatic stellate cell, HSC)是肝纖維化形成的關(guān)鍵細胞[4],HSC可表達AT1[5]。NASH的病理并不十分清楚,但在大多數(shù)情況下與胰島素抵抗相關(guān)[6]。替米沙坦(telmisatan, Tel)是AT1拮抗劑,可作為選擇性的過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator-activated receptor, PPAR γ)激動劑,起到胰島素增敏作用[7]。本研究通過膽堿缺乏的氨基酸(choline-deficient L-amino acid-defined, CDAA)飼料誘導NASH模型[8],探討Tel對NASH相關(guān)性肝纖維化形成的影響。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 實驗動物:清潔級雄性Wistar大鼠,6周齡,體質(zhì)量140 ~150 g[延邊大學醫(yī)學部實驗動物中心提供,合格證號SCXK (吉) 2011- 0007 ] 飼養(yǎng)溫度23 ℃±2 ℃;濕度50%±20%;12 h光照和黑夜循環(huán),水和食物均為隨意攝取。

    1.1.2 動物飼料:CDAA飼料和含膽堿的氨基酸 (choline- supplemented L-amino acid-defined, CSAA) 飼料購于南通特洛菲飼料科技有限公司。替米沙坦(江蘇萬邦制藥),研磨成粉末后與CDAA和CSAA飼料均勻混合,最終達到每只大鼠進食Tel的量為0.5、1.0和2.5 mg/(kg BW)。

    1.1.3 主要試劑:大鼠透明質(zhì)酸 (hyaluronic acid, HA) ELISA試劑盒(上海凱博生物),偶氮卡紅(Azan)染色試劑盒(American MasterTech公司),免疫組化ABC試劑盒(Vector Laboratories公司),α-平滑肌激動蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)抗體(Dako公司),轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)抗體(Santa Cruz公司),總RNA提取試劑盒(Qiagen公司),cDNA合成用AMV反轉(zhuǎn)錄試劑(Roche公司)。

    1.2 方法

    1.2.1 實驗動物模型分組:大鼠以普通飼料喂養(yǎng)1周后,隨機均分為6組。兩組用CSAA飼料喂養(yǎng),添加不同濃度的Tel,最終達到每只大鼠進食Tel的量分別為0(CSAA組)和2.5 mg/(kg BW) (CSAA治療組);模型組以CDAA飼料喂養(yǎng),添加不同濃度的Tel,最終達到每只大鼠進食Tel的量分別為0(CDAA組)、0.5 (低)、1.0 (中)和2.5 mg/(kg BW) (高濃度組)。實驗周期為10周,為使各組大鼠的進食量相等,在飼料完全消耗后添加新的飼料。10周末,所有大鼠禁食12 h后,水合氯醛(250 mg/Kg)麻醉下稱取體質(zhì)量后,經(jīng)腹主動脈采血,常規(guī)制備血清;再取出肝臟并稱取質(zhì)量,留取肝右葉組織,制備病理組織和免疫組織化學標本,部分于-80 ℃凍存。

    1.2.2 檢測血清纖維化及肝功能指標:按試劑盒要求用ELISA方法檢測HA;生化法檢測總膽汁酸(to-tal bile acid, TBA),堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP),γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(γ-gluamyl transpeptidase, γ-GTP),丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase, ALT)和總膽紅素(total bilirubin, TBIL)。

    1.2.3 免疫組化法檢測:α-SMA和TGF-β1經(jīng)甲醛固定的石蠟包埋的肝臟標本,切成5 μm厚用于Azan stain和免疫組化。Azan染色按試劑盒說明操作,測定細胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)沉積的表達。免疫組化按既往的抗生物素蛋白-生物素-過氧化物酶復合物法[9],使用Vectastain ABC試劑盒,α-SMA抗體稀釋為1∶250,TGF-β1抗體稀釋為1∶100。定量分析使用了Motic Med 6.0數(shù)碼醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)(xiamen motic software engineering Co., LTD)。

    1.2.4 實時定量PCR法檢測Ⅰ型前膠原、纖維降解基因和促纖維化基因:凍存的肝組織總RNA提取和cDNA合成分別使用了相應(yīng)的試劑盒,按照如前[9]的檢測方法,測定了Ⅰ型前膠原(type Ⅰ procollagen)、金屬基質(zhì)蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)、金屬蛋白酶組織抑制物(tissue inhibitor of metalloproteinases, TIMPs)信使RNA(messenger RNA, mRNA)的量,引物如前所示[10]。

    1.3 統(tǒng)計學分析

    采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件對實驗結(jié)果進行分析,計量資料以均數(shù)±標準差(x±s)表示,用t檢驗進行統(tǒng)計學分析。

    2 結(jié)果

    2.1 各組大鼠體質(zhì)量和肝臟質(zhì)量

    CDAA添加Tel后大鼠體質(zhì)量隨著Tel濃度的增加而減少,與CDAA組比較Plt;0.05或Plt;0.01。另一方面,CDAA添加Tel后大鼠的肝臟質(zhì)量均較CDAA組大鼠的減輕(表1)。

    表1 各組大鼠的體質(zhì)量及肝質(zhì)量

    *Plt;0.05,**Plt;0.01 compared with CSAA group;#Plt;0.05,##Plt;0.01 compared with CDAA group.

    2.2 各組大鼠的肝臟血清生化學結(jié)果

    喂食CDAA同時添加不同劑量的Tel,血漿中HA含量均低于CDAA組,各組隨著Tel濃度的增加HA含量逐漸減少,且均高于CSAA組。血清TBA, ALP,γ-GTP和TBIL也顯示了相似的結(jié)果。而血清ALT水平在CDAA添加Tel后,各組均高于CDAA組,且隨著Tel濃度的增加而上升,但在CSAA組和CSAA治療組之間無差異(表2)。

    2.3 各組大鼠肝纖維化程度

    CDAA組顯示了明顯的纖維化,添加了不同劑量的Tel后,肝纖維化程度逐漸減輕,圖像分析結(jié)果表明,添加Tel后各組纖維陽性面積與CDAA組比較均減少(Plt;0.01)(圖1)。

    2.4 肝組織α-SMA和TGFβ1的表達

    Alpha-SMA在CDAA組的肝臟中明顯表達,并主要沿著纖維地帶分布。α-SMA陽性面積在添加了Tel組明顯少于CDAA組。定量分析顯示,添加Tel組的α-SMA陽性面積與CDAA組比較均減少(Plt;0.01)(圖2)。TGFβ1陽性所見主要分布于纖維隔膜區(qū)域,圖像分析表明CDAA組明顯高于Tel添加組(均Plt;0.01)(圖3)。

    表2 各組大鼠血清中的HA、TBA、ALP、ALT、r-GT及Tbil水平Table 2 The lever of HA, TBA, ALP, ALT, r-GT and Tbil in serum of each group rats(±s,n=10)

    *Plt;0.01 compared with CSAA group;#Plt;0.05,##Plt;0.01 compared with CDAA group.

    2.5 肝組織纖維化基因的表達

    CDAA組的Ⅰ型前膠原的mRNA明顯高于Tel添加組,且隨著Tel的劑量的增加,其表達逐漸減少,同時MMP- 13的表達上升;添加Tel后,肝組織表達MMP- 2和9以及它們的抑制物TIMP- 1和2均同時下降(圖4)。上述各項指標在CSAA組和CSAA治療組之間無任何差異,且均與CDAA組和Tel添加組之間存在顯著差異,故數(shù)據(jù)未逐一列出。

    3 討論

    NASH的發(fā)病機理尚不十分清楚,喂食CDAA飼料的大鼠,能發(fā)展為脂肪肝、 肝硬化和肝細胞癌,大鼠喂食CDAA飼料后1周可發(fā)展為脂肪肝,第4周開始出現(xiàn)肝纖維化,此后分別從第12周和第30周進展為肝硬化或肝細胞癌[11]。本研究的主要目的是觀察Tel對CDAA飼料誘導的肝纖維化形成的影響,因此設(shè)計了喂食CDAA飼料10周,這一肝纖維化基本形成階段進行研究。文獻報道表明,PPAR γ在調(diào)節(jié)碳水化合物和脂質(zhì)代謝中起重要作用,PPAR γ的配體能提高胰島素敏感性[12],它的全配體,常常伴隨液體潴留、體質(zhì)量增加和浮腫[7]。而Tel不同,它是作為PPAR γ的部分配體。從本研究中可以看出,Tel的用量與臨床上口服量相一致時,即可作為PPAR γ的一種選擇性調(diào)節(jié)劑,還可作為AT1的拮抗劑,在進食量絕對相等的情況下,Tel控制了CDAA引起的大鼠體質(zhì)量的增加,這一結(jié)果與其他研究報道一致[13]。同樣,由于Tel可控制CDAA引起的肝臟中脂肪的沉積,故添加Tel后肝臟質(zhì)量比CDAA組的輕。因此,Tel比起其他的血管緊張素受體的拮抗劑更適合治療NASH相關(guān)的肝纖維化。

    A.CDAA; B.CDAA+Tel+low; C.CDAA+Tel+med;D.CDAA+Tel-high;*Plt;0.05,**Plt;0.01 compared with CDAA group

    圖1Azan染色檢測大鼠肝臟纖維化程度
    Fig1ExtentofECMwasdetectedbyAzanstain(×40)

    A.CDAA; B.CDAA+Tel+low; C.CDAA+Tel+med;D.CDAA+Tel-high; *Plt;0.01 compared with CDAA group

    A.CDAA; B.CDAA+Tel+low; C.CDAA+Tel+med;D.CDAA+Tel-high; *Plt;0.01 compared with CDAA group

    *Plt;0.01 compared with CDAA group圖4 Real-time PCR檢測肝組織中纖維化形成基因和纖維化降解基因的mRNA水平Fig 4 The mRNA expression level of fibrogensis and fibrolysis genes in each group was detected by real-time PCR

    血清HA、TBA和ALP水平與肝纖維化程度相平行, 本研究結(jié)果說明,添加Tel組的肝纖維化程度降低了。CDAA添加Tel后血清ALT水平高于CDAA組,說明添加Tel組的大鼠肝組織中尚存較多的肝細胞,而CDAA組的大鼠已經(jīng)發(fā)展成了嚴重的肝纖維化,殘留的肝細胞數(shù)量明顯減少。CSAA組與CSAA治療組之間ALT水平無差異,證明Tel對大鼠肝細胞無損傷作用。

    添加Tel的大鼠肝臟組織表達ECM的量明顯少于CDAA組,進一步證實了Tel可抑制CDAA誘導的大鼠肝纖維化的形成。HSC通過活化在肝纖維化形成中起重要作用[4],α-SMA是HSC活化的金標準,添加Tel后大鼠肝組織對其表達明顯減少,說明了Tel可通過抑制HSC的活化控制肝纖維化形成。TGF β1在RAS相關(guān)的肝纖維化發(fā)展中起重要作用,Ⅰ型膠原是肝纖維化時ECM的最主要成分,而TGF β1是促進HSC活化而產(chǎn)生膠原的最強因子。添加Tel后大鼠肝組織表達Ⅰ型膠原和TGF β1的量明顯下降。已知肝纖維化可被MMPs降解,而MMPs的活性又可被它們的抑制物TIMPs所抵抗[14]。本研究中,添加Tel后肝臟表達MMP- 13 增加,MMP- 13是降解ECM的主要因子;另一方面,添加Tel后肝臟表達MMP- 2,9 和TIMP- 1,2的量比CDAA組減少,說明它們的表達與肝纖維化的程度相平行,這與其他文獻報道一致[15]。

    NAFLD是一種代謝綜合征,Tel主要用于控制血壓,它同時能控制患者的體質(zhì)量,并且對NAFLD相關(guān)的肝纖維化的發(fā)生有預防作用,是一種有前景的治療NAFLD藥物。

    [1] Argo CK, Caldwell SH. Epidemiology and natural history of non-alcoholic steatohepatitis [J]. Clin Liver Dis, 2009, 13:511- 531.

    [2] Starley BQ, Calcagno CJ, Harrison SA. Nonalcoholic fatty liver disease and hepatocellular carcinoma: a weighty connection [J]. Hepatology, 2010, 51:1820- 1832.

    [3] Bataller R, Gabele E, Parsons CJ,etal. Systemic infusion of angiotensinⅡexacerbates liver fibrosis in bile duct-ligated rats[J]. Hepatology, 2005, 41:1046- 1055.

    [4] Puche JE, Saiman Y, Friedman SL. Hepatic stellate cells and liver fibrosis [J]. Compr Physiol, 2013,3:1473- 1492.

    [5] Zhang Y, Yang X, Wu P,etal. Expression of angiotensin II type 1 receptor in rat hepatic stellate cells and its effects on cell growth and collagen production [J]. Horm Res, 2003, 60:105- 110.

    [6] Marchesini G, Brizi M, Morselli-Labate AM,etal. Association of nonalcoholic fatty liver disease with insulin resistance [J]. Am J Med, 1999, 107:450- 455.

    [7] Benson SC, Pershadsingh HA, Ho CI,etal. Identification of telmisartan as a unique angiotensinⅡreceptor antagonist with selective PPAR gamma-modulating activity [J]. Hypertension, 2004, 43:993- 1002.

    [8] Nanji AA. Animal models of nonalcoholic fatty liver disease and steatohepatitis [J]. Clin Liver Dis, 2004, 8:559- 574.

    [9] Jin H, Sakaida I, Tsuchiya M,etal. Herbal medicine Rhei rhizome prevents liver fibrosis in rat liver cirrhosis induced by a choline-deficient L-amino acid-defined diet[J]. Life Sci, 2005, 76:2805- 2816.

    [10] Jin H, Terai S, Sakaida I. The iron chelator deferoxamine causes activated hepatic stellate cells to become quiescent and to undergo apoptosis [J]. J Gastroenterol, 2007, 42:475- 484.

    [11] Sakaida I, Kubota M, Kayano K,etal. Prevention of fibrosis reduces enzyme-altered lesions in the rat liver [J]. Carcinogenesis, 1994, 15:2201- 2206.

    [12] Picard F, Auwerx J. PPAR (gamma) and glucose homeostasis [J]. Annu Rev Nutr, 2002, 22:167- 197.

    [13] Sugimoto K, Qi NR, Kazdova L,etal. Telmisartan but not valsartan increases caloric expenditure and protects against weight gain and hepatic steatosis [J]. Hypertension, 2006,47:1003- 1009.

    [14] Benyon RC, Hovell CJ, Da Gaca M,etal. Progelatinase A is produced and activated by rat hepatic stellate cells and promotes their proliferation [J]. Hepatology, 1999, 30:977- 986.

    [15] Kossakowska AE, Hinek A, Edwards DR,etal. Altered balance between matrix metalloproteinases and their inhibitors in experimental biliary fibrosis [J]. Am J Pathol, 1998, 153:1895- 1902.

    Inhibitory effect of telmisartan on non-alcoholic fatty liver fibrosis in rats

    LI Xin, JIN Ai-hua, HUANG Yuan, LI Cheng-hao, JIN Hai-yan*

    (Dept. of Gastroenterology and Hepatology, the Affiliated Hospital of Yanbian University, Yanji 133000, China)

    ObjectiveTo study the inhibited effect of telmisartan (Tel) on non-alcoholic fatty liver fibrosis (NLFLF) in rats.MethodsSixty Wistar rats were randomly and equally divided into 6 groups. Two groups of them supplied with choline-supplemented L-amino acid-defined diet(CSAA): CSAA group fed with CSAA diet only, CSAA treatment group fed with CSAA diet and supplemented with Tel of 2.5 mg/(kg BW·d)(CSAA+Tel-high). The residual four groups fed with choline-deficient L-amino acid-defined (CDAA) diet and supplemented with Tel of 0(CDAA), 0.5 (CDAA+Tel-low), 1.0(CDAA+Tel-med) and 2.5(CDAA+Tel-high) mg/(kg BW·d). The total experimental period was 10 weeks. Serum biological parameters were routinely determined. Expression of α-smooth muscle actin (α-SMA) and transforming growth factor-β1 (TGF-β1) in liver tissue were determined by immunohistochemistry, and pathological changes in liver tissues were detected by Azan staining. The

    messenger RNA (mRNA) expressions of type I procollagen, matrix metalloproteinases (MMPs) and tissue inhibitor of metalloproteinase (TIMPs) were evaluated using real-time quantitative PCR.ResultsThe levels of hyaluronic acid, alkaline phosphatase, γ-gluamyl transpeptidase and total bilirubin in serum of CDAA group were all higher than those of CDAA diet supplemented with Tel (Plt;0.05 orPlt;0.01). The quantity of α-SMA and TGF-β1 was higher in CDAA rats compared with Tel treated rats(Plt;0.01). The mRNA of type I procollagen was higher than that of the Tel treated rats(Plt;0.01), and that decreasing as the dose of Tel increasing; on the same time, the expression of MMP13 increased, while the expression of MMP2,9 and TIMP1,2 decreased. Tel also controlled the body weight gain of CDAA diet rats.ConclusionsTel suppresses NLFLF in rats through inhibiting HSCs activation, it may become a promising medicine to control non-alcoholic fatty liver disease.

    telmisartan; liver fibrosis; hepatic stellate cell; non-alcoholic fatty liver disease

    2014- 02- 07

    2014- 04- 21

    國家自然科學基金(81160059);吉林省科技廳項目(200905210);吉林省教育廳“十二五”科學技術(shù)研究項目(201208)

    *通信作者(correspondingauthor):jinhyyj@msn.com

    1001-6325(2014)10-1321-06

    R 575

    A

    猜你喜歡
    米沙坦膠原酒精性
    非酒精性脂肪性肝病的中醫(yī)治療
    肝博士(2022年3期)2022-06-30 02:49:06
    氫氯噻嗪聯(lián)合替米沙坦用于高血壓治療的有效性分析
    清肝二十七味丸對酒精性肝損傷小鼠的保護作用
    中成藥(2018年2期)2018-05-09 07:19:34
    大黃蟄蟲丸對小鼠酒精性肝纖維化損傷的保護作用
    中成藥(2017年12期)2018-01-19 02:06:28
    膠原無紡布在止血方面的應(yīng)用
    紅藍光聯(lián)合膠原貼治療面部尋常痤瘡療效觀察
    替米沙坦對慢性腎臟病患者血清BMP-7的影響
    替米沙坦和纈沙坦治療原發(fā)性高血壓的臨床效果及最小成本分析
    非酒精性脂肪肝的診療體會
    膠原ACE抑制肽研究進展
    食品科學(2013年13期)2013-03-11 18:24:42
    国产黄色视频一区二区在线观看| 国产一区二区在线观看av| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 深夜精品福利| 十八禁高潮呻吟视频| 高清在线视频一区二区三区| 久久久久久久亚洲中文字幕| 男女午夜视频在线观看 | 尾随美女入室| 一区二区日韩欧美中文字幕 | 男女免费视频国产| 边亲边吃奶的免费视频| 久久免费观看电影| 在线观看免费日韩欧美大片| 日韩伦理黄色片| 色婷婷av一区二区三区视频| 精品午夜福利在线看| 九色成人免费人妻av| 制服人妻中文乱码| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 看免费av毛片| av不卡在线播放| 日韩一区二区三区影片| 一边摸一边做爽爽视频免费| 亚洲国产精品999| 日韩av在线免费看完整版不卡| 亚洲综合色网址| 日韩欧美精品免费久久| av线在线观看网站| 99精国产麻豆久久婷婷| 国产一区亚洲一区在线观看| 9热在线视频观看99| 国产日韩欧美在线精品| 亚洲精品国产色婷婷电影| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 久久久久久久国产电影| 欧美+日韩+精品| av在线观看视频网站免费| 97在线视频观看| av电影中文网址| 久久精品久久久久久久性| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 国产精品一二三区在线看| 国产精品国产三级国产专区5o| 欧美成人精品欧美一级黄| 国产高清三级在线| 精品一区二区三卡| 人妻一区二区av| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 欧美日韩综合久久久久久| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 国产免费一级a男人的天堂| 午夜日本视频在线| 国产精品一国产av| 亚洲av男天堂| 免费av中文字幕在线| 亚洲色图综合在线观看| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 亚洲国产精品成人久久小说| 青春草国产在线视频| 熟妇人妻不卡中文字幕| 日本欧美视频一区| 熟女av电影| 欧美日韩综合久久久久久| 日韩一本色道免费dvd| 婷婷色综合大香蕉| 七月丁香在线播放| 男女国产视频网站| 日日摸夜夜添夜夜爱| 春色校园在线视频观看| 99热全是精品| 亚洲少妇的诱惑av| 亚洲欧美成人精品一区二区| 看十八女毛片水多多多| 国产成人精品无人区| av在线观看视频网站免费| 桃花免费在线播放| 欧美少妇被猛烈插入视频| xxxhd国产人妻xxx| 亚洲四区av| 久久精品久久久久久久性| 乱人伦中国视频| 秋霞伦理黄片| 久久久国产精品麻豆| 久久久亚洲精品成人影院| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 午夜免费鲁丝| 日本欧美国产在线视频| 国产成人欧美| 在线观看免费视频网站a站| 五月开心婷婷网| 久久久久久久久久久久大奶| 日韩精品有码人妻一区| www.熟女人妻精品国产 | 国产毛片在线视频| 99视频精品全部免费 在线| 午夜日本视频在线| 亚洲综合色惰| av一本久久久久| 9191精品国产免费久久| 国产亚洲一区二区精品| 中文字幕制服av| 午夜视频国产福利| 亚洲中文av在线| 永久网站在线| 久久精品国产自在天天线| 亚洲av福利一区| 国产av国产精品国产| a 毛片基地| 内地一区二区视频在线| 少妇的逼水好多| 成人免费观看视频高清| 大话2 男鬼变身卡| 两性夫妻黄色片 | 我要看黄色一级片免费的| 少妇人妻精品综合一区二区| 新久久久久国产一级毛片| 熟女av电影| 久久99一区二区三区| 26uuu在线亚洲综合色| 国产片内射在线| 我要看黄色一级片免费的| 欧美 日韩 精品 国产| 久久精品aⅴ一区二区三区四区 | 少妇被粗大的猛进出69影院 | 大片电影免费在线观看免费| 热re99久久国产66热| 亚洲精品456在线播放app| 看免费成人av毛片| 国产一区二区在线观看av| 又黄又粗又硬又大视频| 免费在线观看完整版高清| 午夜av观看不卡| 国产av国产精品国产| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃 | a 毛片基地| 亚洲欧美成人精品一区二区| 精品国产一区二区久久| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 男人添女人高潮全过程视频| 两性夫妻黄色片 | 亚洲性久久影院| 中文字幕人妻熟女乱码| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 一区二区av电影网| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 成人午夜精彩视频在线观看| av免费观看日本| 久久午夜福利片| 日本欧美视频一区| 91国产中文字幕| 久久国产亚洲av麻豆专区| 97在线人人人人妻| 美女大奶头黄色视频| 两个人看的免费小视频| 丁香六月天网| 日韩一本色道免费dvd| 天美传媒精品一区二区| 久久久久久久亚洲中文字幕| 亚洲精品视频女| 日本av手机在线免费观看| 国产乱人偷精品视频| 男女免费视频国产| 免费观看性生交大片5| 伊人久久国产一区二区| 中文字幕人妻丝袜制服| 亚洲国产av新网站| 成人影院久久| 亚洲国产色片| 中文字幕免费在线视频6| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 日本免费在线观看一区| 看非洲黑人一级黄片| 国产成人av激情在线播放| 99热全是精品| 久久久精品免费免费高清| 亚洲av日韩在线播放| 亚洲av.av天堂| 最近中文字幕高清免费大全6| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 天天影视国产精品| 色网站视频免费| 日韩伦理黄色片| 91在线精品国自产拍蜜月| 久久人人爽人人片av| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 性高湖久久久久久久久免费观看| 一区二区av电影网| 精品国产国语对白av| 久久精品国产a三级三级三级| www.av在线官网国产| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 少妇 在线观看| 亚洲中文av在线| 大片电影免费在线观看免费| 如何舔出高潮| 日韩av在线免费看完整版不卡| 激情五月婷婷亚洲| 国产片特级美女逼逼视频| 国产爽快片一区二区三区| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 母亲3免费完整高清在线观看 | 久久国产精品大桥未久av| 人人妻人人澡人人看| 看免费av毛片| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 国产成人一区二区在线| 大香蕉久久成人网| 夫妻午夜视频| 夜夜骑夜夜射夜夜干| av在线app专区| 精品熟女少妇av免费看| 少妇人妻久久综合中文| 精品高清国产在线一区| 亚洲精品国产区一区二| a级片在线免费高清观看视频| а√天堂www在线а√下载 | 国产男靠女视频免费网站| 国产精品九九99| 欧美色视频一区免费| 黄片播放在线免费| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 国产精品国产av在线观看| av超薄肉色丝袜交足视频| 国产成人免费观看mmmm| 午夜91福利影院| av线在线观看网站| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 香蕉国产在线看| 91大片在线观看| 久热爱精品视频在线9| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 电影成人av| 欧美一级毛片孕妇| 黑人操中国人逼视频| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 国产一区二区三区综合在线观看| 久久午夜亚洲精品久久| 精品一区二区三区av网在线观看| 亚洲精品国产区一区二| 亚洲熟妇熟女久久| 日韩有码中文字幕| 99久久99久久久精品蜜桃| 国产日韩欧美亚洲二区| 国产熟女午夜一区二区三区| 一级a爱视频在线免费观看| 久久久久久久午夜电影 | 久热爱精品视频在线9| 国产男女超爽视频在线观看| 黄色毛片三级朝国网站| 一二三四社区在线视频社区8| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 欧美 日韩 精品 国产| 精品福利永久在线观看| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 黄色丝袜av网址大全| 午夜影院日韩av| 久9热在线精品视频| 九色亚洲精品在线播放| 久久精品国产亚洲av高清一级| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 欧美精品高潮呻吟av久久| 69精品国产乱码久久久| 激情在线观看视频在线高清 | 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 黑丝袜美女国产一区| 精品国产乱子伦一区二区三区| 午夜福利欧美成人| 中文字幕色久视频| 成人国产一区最新在线观看| 成人黄色视频免费在线看| 精品福利观看| 高清黄色对白视频在线免费看| 免费观看精品视频网站| 日本精品一区二区三区蜜桃| 欧美精品av麻豆av| 国产高清激情床上av| 亚洲视频免费观看视频| 高清av免费在线| 国产精品影院久久| 一进一出抽搐动态| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 国产av又大| 变态另类成人亚洲欧美熟女 | 国产精品.久久久| 最近最新中文字幕大全电影3 | 国产亚洲欧美98| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 青草久久国产| 国产精品一区二区精品视频观看| 极品教师在线免费播放| 亚洲av片天天在线观看| 成人免费观看视频高清| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 亚洲男人天堂网一区| 久久久国产一区二区| 国产男靠女视频免费网站| 午夜精品久久久久久毛片777| 一级黄色大片毛片| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 超碰成人久久| 男女之事视频高清在线观看| 脱女人内裤的视频| 一级a爱片免费观看的视频| 午夜福利在线观看吧| 人人澡人人妻人| 久久婷婷成人综合色麻豆| 午夜福利在线免费观看网站| 国产精品亚洲av一区麻豆| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 日韩欧美一区视频在线观看| 两性夫妻黄色片| 搡老熟女国产l中国老女人| 精品亚洲成国产av| 国产av精品麻豆| 午夜成年电影在线免费观看| 一边摸一边做爽爽视频免费| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 十八禁人妻一区二区| 淫妇啪啪啪对白视频| 极品少妇高潮喷水抽搐| 久久精品91无色码中文字幕| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 亚洲 欧美一区二区三区| 精品人妻1区二区| 亚洲七黄色美女视频| 黄色a级毛片大全视频| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 免费不卡黄色视频| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 欧美日韩一级在线毛片| 在线观看免费视频日本深夜| 欧美日韩成人在线一区二区| 又紧又爽又黄一区二区| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 日本欧美视频一区| 日本vs欧美在线观看视频| 久久婷婷成人综合色麻豆| 久久精品亚洲av国产电影网| 久久国产精品影院| a在线观看视频网站| 老司机深夜福利视频在线观看| 亚洲九九香蕉| 一区二区三区国产精品乱码| 露出奶头的视频| 精品午夜福利视频在线观看一区| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 极品人妻少妇av视频| 动漫黄色视频在线观看| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 国产精品国产av在线观看| 亚洲国产中文字幕在线视频| 精品亚洲成国产av| 狂野欧美激情性xxxx| 大型黄色视频在线免费观看| 性少妇av在线| 国产精品国产高清国产av | 久热爱精品视频在线9| 久久中文字幕一级| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 国产精品香港三级国产av潘金莲| 欧美一级毛片孕妇| avwww免费| 欧美黄色淫秽网站| 在线观看一区二区三区激情| 亚洲免费av在线视频| 午夜影院日韩av| 在线观看日韩欧美| 国产在线一区二区三区精| 午夜老司机福利片| 国产精品久久久久久精品古装| av超薄肉色丝袜交足视频| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 国产精品.久久久| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 久久人妻av系列| 亚洲,欧美精品.| 午夜成年电影在线免费观看| 国产精品免费一区二区三区在线 | 老司机在亚洲福利影院| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 老司机深夜福利视频在线观看| 一个人免费在线观看的高清视频| 日韩免费高清中文字幕av| 久久久水蜜桃国产精品网| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 国产一区二区激情短视频| 黑人欧美特级aaaaaa片| www.999成人在线观看| 亚洲精品国产色婷婷电影| 宅男免费午夜| 最近最新中文字幕大全电影3 | 国产av精品麻豆| 精品久久久精品久久久| 男女下面插进去视频免费观看| 中文字幕精品免费在线观看视频| 人成视频在线观看免费观看| 激情在线观看视频在线高清 | 不卡一级毛片| 黄片大片在线免费观看| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 在线观看免费午夜福利视频| videos熟女内射| 精品一区二区三区四区五区乱码| 精品久久久久久,| 亚洲精品乱久久久久久| 免费黄频网站在线观看国产| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 久久狼人影院| xxx96com| 啦啦啦免费观看视频1| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 国产精品国产av在线观看| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 在线免费观看的www视频| 黄色丝袜av网址大全| 欧美黄色片欧美黄色片| www.熟女人妻精品国产| 亚洲熟妇中文字幕五十中出 | 在线观看66精品国产| 性色av乱码一区二区三区2| www日本在线高清视频| 天天操日日干夜夜撸| 99国产精品一区二区三区| 母亲3免费完整高清在线观看| 成年人午夜在线观看视频| 中亚洲国语对白在线视频| 欧美精品啪啪一区二区三区| 日韩大码丰满熟妇| 国产成人欧美| 国产欧美日韩精品亚洲av| 日日爽夜夜爽网站| 岛国毛片在线播放| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 亚洲黑人精品在线| 久热爱精品视频在线9| 成年人黄色毛片网站| 天堂俺去俺来也www色官网| 中文字幕人妻熟女乱码| 成人国产一区最新在线观看| 99久久综合精品五月天人人| 1024香蕉在线观看| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 亚洲成人国产一区在线观看| 男女高潮啪啪啪动态图| 天堂动漫精品| 丁香六月欧美| 18禁美女被吸乳视频| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 亚洲人成电影观看| 三上悠亚av全集在线观看| 黄色片一级片一级黄色片| 波多野结衣av一区二区av| 国产区一区二久久| 亚洲色图av天堂| 亚洲久久久国产精品| svipshipincom国产片| 欧美av亚洲av综合av国产av| 日本一区二区免费在线视频| av不卡在线播放| 男女床上黄色一级片免费看| 亚洲人成电影免费在线| 美女国产高潮福利片在线看| 99国产综合亚洲精品| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 亚洲男人天堂网一区| 成年女人毛片免费观看观看9 | 亚洲全国av大片| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 三上悠亚av全集在线观看| 亚洲精品自拍成人| 国产亚洲精品一区二区www | 国产人伦9x9x在线观看| 亚洲少妇的诱惑av| 99久久国产精品久久久| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 久久精品国产亚洲av高清一级| 国产成人免费无遮挡视频| 91精品三级在线观看| 午夜久久久在线观看| tube8黄色片| 一级作爱视频免费观看| 9热在线视频观看99| 男女免费视频国产| 亚洲av片天天在线观看| 女人久久www免费人成看片| 亚洲情色 制服丝袜| 午夜福利一区二区在线看| 人人妻人人澡人人看| 国产精品综合久久久久久久免费 | 国产熟女午夜一区二区三区| 岛国在线观看网站| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 黄色毛片三级朝国网站| 老汉色av国产亚洲站长工具| 夫妻午夜视频| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 视频区图区小说| 日韩中文字幕欧美一区二区| 最近最新中文字幕大全免费视频| 窝窝影院91人妻| 老汉色av国产亚洲站长工具| 亚洲精品国产色婷婷电影| 久久精品国产亚洲av香蕉五月 | 国产成人欧美| 电影成人av| 午夜激情av网站| 黄频高清免费视频| 校园春色视频在线观看| 亚洲成人免费av在线播放| 制服诱惑二区| 久久久久久免费高清国产稀缺| 免费人成视频x8x8入口观看| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 一个人免费在线观看的高清视频| 91精品国产国语对白视频| 宅男免费午夜| 最近最新中文字幕大全电影3 | 国产精品一区二区在线不卡| 一级a爱片免费观看的视频| 中文字幕色久视频| 国产亚洲精品第一综合不卡| 亚洲免费av在线视频| 12—13女人毛片做爰片一| 久久久国产成人免费| 精品一区二区三区视频在线观看免费 | 老熟妇乱子伦视频在线观看| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 一级a爱片免费观看的视频| 高清在线国产一区| 久久国产精品大桥未久av| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 免费观看a级毛片全部| 国产真人三级小视频在线观看| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 久久久国产精品麻豆| 一级a爱视频在线免费观看| 后天国语完整版免费观看| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 精品国产乱子伦一区二区三区| 黄色视频,在线免费观看| 欧美成人午夜精品| 国产av又大| 美女午夜性视频免费| 窝窝影院91人妻| 日韩欧美免费精品| 在线观看www视频免费| 十分钟在线观看高清视频www| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 在线观看免费高清a一片| 国产亚洲精品久久久久5区| 亚洲精品国产区一区二| 老司机福利观看| 人妻一区二区av| 色播在线永久视频| 久久精品国产清高在天天线| 亚洲中文日韩欧美视频| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片 | 亚洲男人天堂网一区| 人妻丰满熟妇av一区二区三区 | 中文字幕高清在线视频| 亚洲性夜色夜夜综合| 在线观看www视频免费| 老司机午夜福利在线观看视频| 国产一卡二卡三卡精品| 亚洲一区二区三区不卡视频| 欧美成狂野欧美在线观看| 在线观看一区二区三区激情| av天堂久久9| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 免费在线观看影片大全网站| 日本vs欧美在线观看视频| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| www日本在线高清视频| 久久精品成人免费网站| 男女午夜视频在线观看| 人妻丰满熟妇av一区二区三区 | 搡老乐熟女国产| 大香蕉久久网| 麻豆成人av在线观看| av片东京热男人的天堂| 国产精品国产av在线观看| 亚洲专区字幕在线| 99香蕉大伊视频| 婷婷精品国产亚洲av在线 | 久久精品国产综合久久久| 国产精品久久视频播放| 国产野战对白在线观看| 搡老乐熟女国产| а√天堂www在线а√下载 | 精品无人区乱码1区二区| 国产精品免费一区二区三区在线 | 国产男靠女视频免费网站| 精品久久久久久久久久免费视频 | 亚洲精品粉嫩美女一区| 在线观看66精品国产| 国产单亲对白刺激| 精品国产美女av久久久久小说| 欧美人与性动交α欧美软件| 精品熟女少妇八av免费久了| 99re在线观看精品视频| 亚洲av片天天在线观看| 久久午夜亚洲精品久久| 国产一区有黄有色的免费视频| 国产1区2区3区精品| 亚洲av电影在线进入| 亚洲专区国产一区二区| 久久久久视频综合|