PPAR-γ配體對絨癌細(xì)胞系JEG- 3體外增殖、分泌和侵襲能力的影響

丁 峰，崔新紅，鈕 彬，邢福祺

(1.解放軍第456醫(yī)院 婦產(chǎn)科, 山東 濟(jì)南 250031； 2.南方醫(yī)科大學(xué) 附屬南方醫(yī)院 生殖中心, 廣東 廣州 510515)

研究論文

PPAR-γ配體對絨癌細(xì)胞系JEG- 3體外增殖、分泌和侵襲能力的影響

丁 峰1，崔新紅1，鈕 彬1，邢福祺2*

(1.解放軍第456醫(yī)院 婦產(chǎn)科, 山東 濟(jì)南 250031； 2.南方醫(yī)科大學(xué) 附屬南方醫(yī)院 生殖中心, 廣東 廣州 510515)

目的觀察PPAR-γ配體吡格列酮(PGZ)調(diào)節(jié)絨癌細(xì)胞系JEG- 3的增殖、分泌hCG和體外侵襲、轉(zhuǎn)移能力。方法用MTT法和IEMA測定細(xì)胞的增殖和分泌hCG。Matrigel侵襲模型分析細(xì)胞的遷徙和侵襲能力。結(jié)果小劑量PGZ對JEG- 3有增殖抑制作用，隨PGZ濃度的增加，JEG- 3透過Matrigel膜的細(xì)胞數(shù)明顯減少(Plt;0.01)。結(jié)論PGZ明顯抑制JEG- 3腫瘤細(xì)胞的生長和侵襲能力，提示PPAR-γ途徑可能是妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤治療的新方向。

妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞疾病; 過氧化物酶增殖體激活受體; 增殖; 絨毛膜促性腺激素; 腫瘤侵襲力

過氧化物酶增殖體激活受體(peroxisome proliferators-activated receptor, PPAR)是核激素受體超家族成員之一，參與脂質(zhì)、葡萄糖代謝、感染、血管形成及腫瘤發(fā)生等過程[1- 3],其3種亞型α、 γ、 β/δ在人滋養(yǎng)細(xì)胞均有表達(dá)，可能與先兆子癇、妊娠期糖尿病、胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩密切相關(guān)[4- 5]。PPAR在母胎界面具有侵蝕能力的絨毛外細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞表達(dá),提示PPAR可能調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細(xì)胞的侵潤行為。在胎盤形成過程中，滋養(yǎng)細(xì)胞侵潤內(nèi)膜不足可導(dǎo)致早期流產(chǎn)、先兆子癇和胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩；侵潤過度可能發(fā)生妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞疾病[6]。本研究觀察PPAR-γ配體-吡格列酮(Pioglitazone，PGZ)是否能調(diào)節(jié)惡性滋養(yǎng)細(xì)胞的生物學(xué)行為。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑

胰蛋白酶(Amresco公司)，膠原蛋白酶和PGZ(Sigma公司)，MTT(Gibco公司)，鼠抗人細(xì)胞角蛋白7 抗體(武漢博士德生物制品公司)，細(xì)胞侵襲分析試劑盒(matrigel chamber)(Chemicom公司)。

1.2 標(biāo)本來源及實驗方法

1.2.1 研究對象: JEG- 3細(xì)胞系(ATCC HTB36)(中國科學(xué)院動物研究所計劃生育生殖生物學(xué)國家重點實驗室贈送)。另取自愿人工流產(chǎn)術(shù)后正常早孕絨毛組織(12周以內(nèi))作為對照(患者知情同意，妊娠后未服用甾體類藥物)。

1.2.2 標(biāo)本采集:

1)組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞：方法見文獻(xiàn)[7]。

2)人絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞的鑒定,將絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞制成細(xì)胞懸液(4×104/mL), 接種到事先放置有載玻片的培養(yǎng)板中, 制備細(xì)胞爬片。細(xì)胞免疫組化法，觀察CK7在滋養(yǎng)細(xì)胞中的表達(dá)。光學(xué)顯微鏡觀察陽性細(xì)胞率gt;95%，證明細(xì)胞純度超過95%，可用于實驗(圖1)。

圖1 培養(yǎng)的滋養(yǎng)細(xì)胞CK7 免疫細(xì)胞化學(xué)染色Fig 1 CK7 immunocytochemistry in cultured trophoblastcells(×200)

3)JEG- 3細(xì)胞培養(yǎng)及傳代，JEG- 3細(xì)胞(MEM培養(yǎng)液)貼壁郵票樣生長，長滿瓶壁的80%～90%(約7 d)，進(jìn)行傳代，2%乙二胺四乙酸二鈉消化傳代。

1.2.3 實驗方法：

1)MTT法測定細(xì)胞增殖能力，單細(xì)胞懸液(4×105/mL)按每孔100 μL接種于96孔平板，再加入200 μL含20%小牛血清MEM培養(yǎng)液，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)24 h，再無血清培養(yǎng)24 h后，設(shè)空白對照組及0.1、1.0、10和100 μmol/L PGZ處理組各3孔。培養(yǎng)48 h，加入MTT(2 g/L,200 μL/孔)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液(分裝于艾本德離心管中，-20 ℃凍存，用于人絨毛促性腺激素hCG測定)。96孔板加入DMSO液(150 μL /孔)，室溫下將平板置于微孔板振蕩器上振蕩10 min，使結(jié)晶物溶解。酶標(biāo)儀檢測各孔A值(A=570 nm)，記錄結(jié)果，繪制細(xì)胞活力曲線圖。

2)磁性微粒分離的免疫酶聯(lián)法(IEMA)測定細(xì)胞分泌hCG能力，前述培養(yǎng)液及各濃度標(biāo)準(zhǔn)液、對照液各2份加入試管，分別加入0.2 mL凝血酶原抗絨毛膜促性腺激素試劑,孵育后用分離液進(jìn)行磁性分離,去掉上清液并清洗試管后強(qiáng)烈振蕩, 磁性顆粒沉淀,加入基質(zhì)液第2次孵育，終止液終止反應(yīng)。用空白管在550 nm波長校正光度計零點，在550 nm和492 nm波長測標(biāo)準(zhǔn)液、對照液及標(biāo)本的吸收率。

3)細(xì)胞侵襲能力測定，實驗分組及處理按實驗方法1，培養(yǎng)48 h后收集各組細(xì)胞,分別將各組細(xì)胞用PBS洗滌2次, 按試劑盒操作說明, 將細(xì)胞懸液200 μL加入細(xì)胞侵襲分析試劑盒小室的上室, 而在下室加入500 μL含100 mL/L小牛血清的MEM培養(yǎng)液, 繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)24 h。取出濾膜, 拭去濾膜表面殘留細(xì)胞, 固定后經(jīng)試劑盒提供的專用染液染色,200倍光鏡下隨機(jī)選取6個視野, 計數(shù)侵襲到濾膜背面的穿膜細(xì)胞數(shù), 以穿膜細(xì)胞的相對數(shù)目表示細(xì)胞侵襲力的大小。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1PGZ對人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞和JEG-3細(xì)胞增殖能力的影響

PGZ對滋養(yǎng)細(xì)胞的抑制作用不明顯。小劑量PGZ對JEG- 3細(xì)胞有抑制作用，細(xì)胞數(shù)量減少、生存能力下降、細(xì)胞的生長受到抑制，濃度越大抑制作用越強(qiáng)(Plt;0.01)(表1)。

2.2PGZ對人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞和JEG-3細(xì)胞分泌hCG的影響

PGZ對滋養(yǎng)細(xì)胞及JEG- 3細(xì)胞分泌hCG有一定抑制作用，無劑量依賴性，亦無明顯差異(表2)。

2.3PGZ對人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞和JEG-3細(xì)胞體外侵襲/遷移能力的影響

PGZ處理后，JEG- 3細(xì)胞透過Matrigel膜的細(xì)胞數(shù)減少，隨PGZ濃度的增加，透過Matrigel膜的細(xì)胞數(shù)明顯減少，有劑量-效應(yīng)關(guān)系，與滋養(yǎng)細(xì)胞相比有顯著性差異(Plt;0.01)(表3)。

3 討論

在胎盤形成過程中，滋養(yǎng)細(xì)胞增生和對子宮內(nèi)膜的侵蝕是受滋養(yǎng)細(xì)胞-子宮內(nèi)膜微環(huán)境中多種因子的嚴(yán)格調(diào)控。絨癌細(xì)胞的增殖和侵蝕不同于正常滋養(yǎng)細(xì)胞，無節(jié)制性的增殖是惡性腫瘤最重要特征。在人胎盤中，PPAR γ特異性地在絨毛細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞、合體滋養(yǎng)細(xì)胞及絨毛外細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞(EVCTs)表達(dá)。

PPAR-γ自然配體15-d-PGJ2能刺激滋養(yǎng)細(xì)胞侵蝕相關(guān)基因adipophilin (adipose differentiation-ralated protein,ADRP)和osteopontin(OPN)的表達(dá)，減弱細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞分化[8]。本資料顯示，PPAR合成配體PGZ抑制正常滋養(yǎng)細(xì)胞的生長，但作用不明顯，對JEG- 3的增殖產(chǎn)生負(fù)調(diào)節(jié)作用，生長曲線呈明顯下降趨勢，發(fā)揮抑制JEG-3腫瘤細(xì)胞生長和增殖的作用，說明PPAR能特異抑制絨癌細(xì)胞的生長，且有劑量依賴關(guān)系，PGZ劑量越大抑制腫瘤生長的能力越強(qiáng)，對腫瘤的生長有抑制作用。腫瘤細(xì)胞的生長是一個復(fù)雜的過程，PPAR通過什么途徑控制JEG- 3的生長，尚不明確。PPAR調(diào)節(jié)多種細(xì)胞的增殖、分化，參與多種組織的生理、病理過程[9- 10]。PPAR-γ具有抗炎性反應(yīng)和MMP抑制劑(TIMP)的作用[11]，與早期的資料相吻合[12]，在惡性滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤中TIMPs較MMPs表達(dá)明顯較弱，不能發(fā)揮阻抑MMP- 2的作用，加速細(xì)胞外基質(zhì)降解、細(xì)胞轉(zhuǎn)移的過程。TIMPs與相應(yīng)的MMPs酶原及其活化形式結(jié)合，從而抑制MMPs的活性，是腫瘤發(fā)生惡變與轉(zhuǎn)移的阻抑基因。

hCG是妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞疾病診斷、監(jiān)測和預(yù)后的重要指標(biāo), JEG- 3、BeWo細(xì)胞分泌hCG的功能均可受外源性KGF的調(diào)節(jié)，能明顯促進(jìn)JEG- 3、BeWo分泌hCG，調(diào)控絨癌細(xì)胞分泌功能[13]。但本資料顯示PGZ對絨癌細(xì)胞JEG- 3和滋養(yǎng)細(xì)胞分泌hCG影響不明顯，與PGZ的劑量無關(guān)，可能PPAR對絨癌、滋養(yǎng)細(xì)胞的保護(hù)作用并不是通過調(diào)節(jié)hCG實現(xiàn)的。

表1 15- d-PGJ2對滋養(yǎng)細(xì)胞和絨癌細(xì)胞系JEG- 3體外增殖能力的影響

*Plt;0.01 compared with tropoblast.

表2 15-d-PGJ2對滋養(yǎng)細(xì)胞和絨癌細(xì)胞系JEG- 3體外分泌hCG的影響Table 2 Effect of pioglitazone on secretion of trophoblast and choriocarnoma cell line in vitro (±s, A value,n=3)

表3 15-d-PGJ2對滋養(yǎng)細(xì)胞和絨癌細(xì)胞系JEG- 3體外侵襲能力的影響

*Plt;0.01 compared with tropoblast.

PPAR-γ抑制滋養(yǎng)細(xì)胞的侵蝕行為，同時PPAR-γ降調(diào)節(jié)具有侵蝕能力的EVCTs分泌的hCG，侵蝕性滋養(yǎng)細(xì)胞分泌的hCG啟動了滋養(yǎng)細(xì)胞的侵蝕過程[14]。體外實驗已證實PPAR在葡萄胎和絨癌組織降表達(dá)，間接說明PPAR在滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤發(fā)展中可能發(fā)揮保護(hù)作用。對絨癌細(xì)胞的體外侵襲能力，PPAR-γ配體PGZ對滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲力無明顯保護(hù)作用，說明PPAR在正常妊娠過程中，不影響滋養(yǎng)細(xì)胞對子宮內(nèi)膜的侵襲。對絨癌細(xì)胞，小劑量PGZ就能減少JEG- 3細(xì)胞通過Matrigel膜的數(shù)量，隨劑量增大，通過Matrigel膜的數(shù)量明顯減少，說明PGZ能降低絨癌細(xì)胞的體外侵襲能力，抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲，從而抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移，具體的調(diào)節(jié)機(jī)制尚不清楚。

早期絨癌經(jīng)化療后預(yù)后好，晚期與復(fù)發(fā)者預(yù)后仍惡劣，雖然化療能明顯提高滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤患者的生存率，但化療的不良反應(yīng)常是患者的致命因素。腫瘤的生物治療和基因治療是目前治療的新方向。PGZ明顯抑制JEG- 3腫瘤細(xì)胞的生長，并一定程度抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲能力，提示PPAR-γ途徑可能是妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤治療的新方向。

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The effect of PPAR-γ ligand on proliferationand secretion and invasion of JEG- 3 choriocarnoma cells in vitro

DING Feng1, CUI Xin-hong1, NIU Bin1, XING Fu-qi2*

(1.Dept. of Obstetrics and Gynecology, 456 Hospital of PLA, Jinan 250031; 2.Dept. of Reproductive Center, Nanfang Hospital, Nanfang Medical University,Guangzhou 510515, China)

ObjectiveTo observe the effect of ligand of peroxisome proliferators-activated receptor gamma (PPAR gamma) on the proliferation and secretion of trophoblast and choriocarnoma cells (JEG- 3) and to study the role played by PPAR gamma during the process of JEG- 3 activation.MethodsWe employed MTT assay to observ the growth of the cells and IEMA the secretion of hCG in the cells. Matrigel invision chambers were performed to analyse the cell migration and invasion.ResultsThe proliferation of JEG- 3 was suppressed by PGZ with a low dose-dependent manner. The numbers of JEG- 3 was obviously inhibited by PGZ(Plt;0.01)with increasing concentration.ConclusionsThe results obtained with thisinvitrosystem demonstrated that PPAR gamma activation may inhibit JEG- 3 proliferation and invasiveness. PPAR gamma may be a new therapeutic target for gestational trophoblastic tumor in humans.

gestational trophoblastic tumor (GTT); peroxisome proliferator-activated receptors (PPARs); proliferation; chorionic gonadotropin(hCG); neoplasm invasion

2013- 12- 12

2014- 04- 21

國家科技部“973”課題(G1999055903)

*通信作者(correspondingauthor)：dfsyw@sina.com

1001-6325(2014)10-1344-04

R 737.33

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