烤煙苗期莖部腐爛病病原菌九州鐮孢菌的生物學(xué)特性

汪漢成，王進，李文紅，陸寧，王茂勝，夏海乾

1煙草行業(yè)煙草分子遺傳重點實驗室,貴州省煙草科學(xué)研究院， 貴陽 550081；

2長江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，荊州 434025；

3貴州省植物保護研究所，貴陽 550006

植物保護

烤煙苗期莖部腐爛病病原菌九州鐮孢菌的生物學(xué)特性

汪漢成1，王進2，李文紅3，陸寧1，王茂勝1，夏海乾1

1煙草行業(yè)煙草分子遺傳重點實驗室,貴州省煙草科學(xué)研究院， 貴陽 550081；

2長江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，荊州 434025；

3貴州省植物保護研究所，貴陽 550006

2012年在烤煙（Nicotiana tabacumL.）苗期發(fā)現(xiàn)莖部腐爛病，經(jīng)病原菌的形態(tài)特征觀察、rDNA-ITS和EF-1α序列分析，該致病菌被鑒定為九州鐮孢菌（Fusarium kyushuense）。該病原菌在利馬豆培養(yǎng)基上生長溫度范圍為5～41℃，最適30℃；分生孢子產(chǎn)生溫度范圍為10～35℃，最適35℃；分生孢子萌發(fā)溫度范圍為5～42℃，最適20～35℃；分生孢子萌發(fā)相對濕度范圍為70%～100%，最適100%；可生長pH值為2～11，最適5～7；光照對菌絲生長和分生孢子萌發(fā)沒有影響，光暗交替培養(yǎng)菌絲生長變慢，但分生孢子產(chǎn)量增加；在供試的95種碳源中，該病原菌能利用葡萄糖、麥芽糖、反丁烯二酸等89種碳源，不能利用N-乙?；鵇-半乳糖胺、N-乙酰基-?-D-葡萄糖胺、葡萄醛酰胺、癸二酸、L-絲氨酸和腺苷-5’-磷酸鹽6種碳源。

烤煙；九州鐮孢菌；生物學(xué)特性

隨著烤煙（Nicotiana tabacumL.）漂浮育苗技術(shù)的推廣和應(yīng)用，煙草苗期病害的發(fā)生越來越嚴重[1]。在高溫高濕和煙苗高度集中的連作模式下，病害極易發(fā)生而且嚴重。2012年4月，作者在貴州省煙草科學(xué)研究院多年連作的烤煙漂浮育苗大棚中發(fā)現(xiàn)了一種煙草莖部腐爛病害。該病害危害嚴重，其主要癥狀表現(xiàn)為在煙苗莖基部（尤其與土壤交接處）形成明顯的深褐色病斑，被侵染煙株表現(xiàn)出萎蔫、黃化，根系發(fā)育受阻等癥狀；隨著病情發(fā)展，煙苗最終從發(fā)病部位折倒而萎蔫死亡。這些癥狀同苗期煙草枯萎病、立枯病、黑脛病等根莖病害的癥狀非常相似。經(jīng)形態(tài)學(xué)特征觀察、病原菌分離及其rDNA-ITS和EF-1α序列分析，證明該病原菌為九州鐮孢菌（Fusarium kyushuense O’Donnell & T.Aoki）[2]。為了解該病害的發(fā)生流行規(guī)律和有效防治方法，作者對該病菌的生物學(xué)特性進行了研究。

1 材料與方法

1.1 病原菌

2012年5月于貴州省煙草科學(xué)研究院溫室大棚內(nèi)采集典型發(fā)病煙株，按常規(guī)方法進行病原菌的分離和純化[3]，純化后的菌株保存于利馬豆培養(yǎng)（LBA）斜面培養(yǎng)基[4]上，置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 病原菌的形態(tài)特征觀察

將純化的病原菌接種到LBA平板上，于25℃黑暗培養(yǎng)，觀察菌落形態(tài)；7 d后從平板上挑取少量菌絲進行鏡檢，觀察大型分生孢子和小型分生孢子，并觀察小型分生孢子的產(chǎn)生方式。

1.3 病原菌的生物學(xué)特性研究

1.3.1 溫度對菌絲生長、分生孢子形成和萌發(fā)的影響

將直徑為5 mm的菌苔移至LBA培養(yǎng)基平板（直徑9cm）上，分別置于5、10、15、20、25、30℃、35和40℃恒溫箱中培養(yǎng)4 d，采用十字交叉法測量菌落的直徑。培養(yǎng)6 d時，每培養(yǎng)皿加入10mL滅菌水，濾去菌絲后用紐鮑爾(Neubauer)血球計數(shù)板計測孢子量。每處理設(shè)3次重復(fù)。

將分生孢子懸浮液稀釋成濃度40倍鏡下每視野30個孢子，取50 μL涂在凹玻片上，分別置于上述8種溫度的恒溫培養(yǎng)箱中保濕培養(yǎng)12 h后鏡檢孢子萌發(fā)率。每一重復(fù)檢查100個孢子，每一處理設(shè)3次重復(fù)。

1.3.2 pH值對菌絲生長的影響

用 1 mol·L-1HCl或 1 mol·L-1NaOH 將滅菌后的利馬豆培養(yǎng)液（LB）分別調(diào)節(jié)pH為2、3、4、5、6、7、8、9、10和11，將直徑為5 mm的菌苔分別移入各pH值的LB培養(yǎng)液中，于搖床（30℃，轉(zhuǎn)速180 r·min-1）中培養(yǎng)6 d后，經(jīng)過濾和菌絲烘干，稱其干重。每一處理設(shè)3次重復(fù)。

1.3.3 光照對菌絲生長、分生孢子形成和萌發(fā)的影響

在LBA培養(yǎng)基上接種直徑為5 mm的菌苔，分別置于3種不同的光照條件（光照培養(yǎng)箱，光照度100%）下培養(yǎng)：設(shè)完全黑暗、12 h光暗交替和完全光照3種處理。在30℃下培養(yǎng)4 d后，測量菌落直徑；培養(yǎng)6 d后測量孢子量。每個處理設(shè)3次重復(fù)。將涂有孢子懸浮液的載玻片分別置于上述3種處理下保濕培養(yǎng)，12 h后鏡檢孢子萌發(fā)率。每一重復(fù)檢查100個孢子，每一處理設(shè)3次重復(fù)。

1.3.4 菌絲和分生孢子致死溫度的測定

將直徑為5 mm的菌苔移至LBA培養(yǎng)基平板上，分別置于40、41、42、43、44和45℃的恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，每處理設(shè)3次重復(fù)。6 d后觀察菌苔是否長出菌絲，確定其致死溫度。將分生孢子懸浮液置于大小一致的試管中，每試管5mL，分別放入40、41、42、43、44和45℃的恒溫水浴鍋中加熱20 min。處理過程中隨時緩緩搖勻試管，以保證溫度均勻。取出后立即在冷水中冷卻。采用載玻片萌發(fā)法，于30℃黑暗條件下培養(yǎng)24 h，鏡檢孢子的萌發(fā)情況，確定分生孢子的致死溫度。

1.3.5 濕度對分生孢子萌發(fā)的影響

采用不同濃度的硫酸在密閉干凈的干燥箱中調(diào)節(jié)空氣的相對濕度。將孢子懸浮液涂于潔凈載玻片上，快速風(fēng)干后，分別置于相對濕度為50%、60%、70%、80%、90%、100%和100%+水膜 7種濕度條件下，于30℃黑暗條件下培養(yǎng)24 h后鏡檢孢子萌發(fā)率，以水膜中的孢子萌發(fā)率為對照。每一處理鏡檢100個孢子，每一處理設(shè)3次重復(fù)。

1.3.6 病原菌的碳源代謝特征分析

采用Biolog FF 96孔微孔板進行病原菌的碳源代謝特征分析[5-6]，按照Biolog公司FF的操作指南進行碳代謝測試。收集在LBA平板上培養(yǎng)7天的病原菌的分生孢子，用無菌分生孢子調(diào)整FF-IF接種液的濁度為75%T,將菌懸液倒入V型加樣水槽中，8通道電動移液器將100 μL菌懸液依次加入微孔板所有孔中，于26℃黑暗培養(yǎng)，96 h后檢測病原菌對95種碳源的代謝情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的形態(tài)特征

病原菌在LBA培養(yǎng)基上生長良好，初為白色菌落，后變?yōu)榧t棕色菌落，氣生菌絲放射狀生長，25℃黑暗培養(yǎng)4 d菌落直徑約為6.5cm；小型分生孢子直或略彎曲，棒狀，具0-3個隔膜，7.5～20.0 μm×2.5～5.0 μm；大分生孢子直或略彎曲，細長，具3-5個隔膜，25.0～45.0 μm ×3.3～5.0 μm (圖1)。

圖1 病原菌的菌落和形態(tài)學(xué)特征Fig.1 Bacterial colony and morphological characteristics of pathogen

2.2 病原菌的生物學(xué)特性

2.2.1 溫度對菌絲生長、分生孢子形成和萌發(fā)的影響

在LBA培養(yǎng)基上，病原菌的菌絲在5～41℃均可生長，最適溫度為30℃，低于10℃或高于35℃時菌落生長明顯受到抑制；病原菌在15～25℃易產(chǎn)生紅色色素；產(chǎn)生分生孢子的溫度范圍是10～35℃，最適溫度為35℃；在保濕條件下，分生孢子在5～42℃溫度范圍內(nèi)均可萌發(fā)，在20～35℃萌發(fā)率達90%以上（表1）。

菌絲在40℃和41℃培養(yǎng)均能生長，在42～45℃培養(yǎng)均不能生長（表1），因此，該病原菌菌絲的致死溫度為42℃。病原菌分生孢子經(jīng)40～42℃處理20 min后均有少量孢子萌發(fā)，經(jīng)43～45℃處理20 min后均無孢子萌發(fā)，因此，該病原菌分子孢子萌發(fā)的致死溫度為43℃。

表1 溫度對九州鐮孢菌菌絲生長、分生孢子產(chǎn)量及其萌發(fā)的影響Tab.1 Impact of temperature on mycelial growth,conidial sporulation and germination of Fusarium kyushuense

2.2.2 pH對菌絲生長的影響

病原菌在pH 2～11范圍內(nèi)均能生長，但中性和偏酸性條件更有利于病菌生長，其最適生長pH范圍為5～7 (表2)。從pH4開始，病菌產(chǎn)生紅色色素，隨著pH升高，菌液顏色逐漸變深且逐漸粘稠。

2.2.3 光照處理對菌絲生長、分生孢子形成及萌發(fā)的影響

光照處理對菌絲的生長沒有明顯的影響。完全光照和完全黑暗條件下菌絲生長速度相近，光暗交替條件下菌絲生長相對較慢（表3）。光暗交替分子孢子產(chǎn)量最高，完全光照和完全黑暗條件下產(chǎn)孢量相近。光照有利于孢子的萌發(fā)，但影響不大（表3）。

表2 酸堿度對九州鐮孢菌菌絲生長的影響Tab.2 pH effect on mycelial growth of Fusarium kyushuense

表3 不同光照處理對九州鐮孢菌菌絲生長、分生孢子形成及其萌發(fā)的影響Tab.3 Impact of light on mycelial growth,conidial sporulation and germination of Fusarium kyushuense

2.2.4 濕度對分生孢子萌發(fā)的影響

在相對濕度100%和黑暗條件下培養(yǎng)24 h，病菌分生孢子的萌發(fā)率為100%；相對濕度為70%時分生孢子幾乎不能萌發(fā)（表4）。表明高濕促進分生孢子萌發(fā)，相對濕度100%最適宜分生孢子萌發(fā)。

2.2.5 病原菌對碳源利用情況

病原菌經(jīng)Biolog FF 微孔板培養(yǎng)96 h后的代謝表型如表5所示，病菌可利用較多種類的碳源。在供試95種碳源中，病原菌能夠代謝利用的種類有89種，包括各種單糖、多糖和氨基酸類；不能代謝利用種類的有6種，主要有N-乙酰基D-半乳糖胺、N-乙?；??-D-葡萄糖胺、葡萄醛酰胺、癸二酸、L-絲氨酸和腺苷-5’-磷酸鹽。

表4 不同濕度處理對九州鐮孢菌分生孢子萌發(fā)的影響Tab.4 Impact of humidity on conidial sporulation and germination of Fusarium kyushuense

表5 九州鐮孢菌在Biolog FF碳源微孔板上的代謝指紋圖譜Tab.5 Metabolic fingerprinting of Fusarium kyushuense on Biolog FF carbon microplate

3 結(jié)論與討論

烤煙苗期莖部腐爛病是近年在貴州煙區(qū)苗床上新發(fā)現(xiàn)的一種重要病害。作者對引起該病害的病原菌的生物學(xué)特性進行了研究，研究結(jié)果對該病害的科學(xué)防治具有指導(dǎo)意義。

鐮孢菌屬(Fusarium)是形態(tài)變異較大而且最難于鑒定的真菌類群之一。特別是氣生菌絲上分生孢子的形態(tài)[7]。不同培養(yǎng)條件下的生長特征，如生長速度、色素、寄主類型、致病性、毒素分泌等通常存在一定的差異，這些也是其種分類的輔助依據(jù)[8]。

本文報道的九州鐮孢菌在其它作物上引起病害的報道卻并不多見，僅在日本侵染小麥和在我國侵染水稻稻穗的報道[9-10]。煙草上由鐮孢菌屬真菌引起的病害主要有枯萎病，病原菌為F.oxysporium f.sp.nicotianae[11]。本文F.kyushuense引起的烤煙苗期莖腐病在國內(nèi)外尚屬首次報道，其有性階段在本文研究的條件下尚未見到，值得進一步深入研究。

生物學(xué)特性測定結(jié)果表明，煙草莖腐病菌F.kyushuense是一種適溫范圍較廣的病原菌，在5～40℃均可以生長，最適溫度為30℃，在15～25℃易產(chǎn)生紅色色素；在10～35℃均可產(chǎn)生分生孢子，最適溫度為35℃，且最適20～35℃萌發(fā)。這些溫度范圍與現(xiàn)代設(shè)施農(nóng)藝下烤煙漂浮育苗4～5月的溫度基本吻合，大棚室內(nèi)的高濕環(huán)境有利于其侵染與危害。在液體利馬豆培養(yǎng)基中，該病原菌在pH2～11范圍均可以生長，具有很強的適應(yīng)性；此外，在供試95種碳源中有89種可以滿足該病原菌生長對營養(yǎng)的需求。這些進一步說明該病原菌具有很強的環(huán)境生存能力。因此，煙草苗期莖部腐爛病在今后烤煙的漂浮育苗過程中應(yīng)引起足夠的重視，該病害一旦流行將會給烤煙生產(chǎn)造成嚴重損失。

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Biological characteristics ofFusarium kyushuensecausing tobacco seedling stem rot

WANG Hancheng1,Wang Jin2,LI Wenhong3,Lu Ning1,WANG Maosheng1,XIA Haiqian1
1 Key Laboratory of Molecular Genetics,Guizhou Academy of Tobacco Sciences,Guiyang 550081,China;
2 College of Life Science,Yangtze University,Jingzhou 434025,China;
3 Guizhou Institute of Plant Protection,Guiyang 550006,China

Stem rot in flue-cured tobacco(Nicotiana tabacumL.) was observed in tobacco seedlings in 2012.Its pathogen was identi fied asFusarium kyushuenseaccording to morphology,pathogenicity and rDNA-ITS and EF-1α gene analysis.The temperature for the pathogen to grow on LBA ranged from 5℃ to 42℃ with an optimum temperature of 30℃,ranged from 10℃ to 35℃ with optimum temperature of 35℃ ;and ranged from 5℃ to 42℃ with optimum temperature of 30℃ to 35℃for conidial germination.The suitable relative humidity for conidial germination of pathogen ranged from 70% to 100%.The pathogen could grow under pH 2-11 with optimum pH 5-7.Light had no effect on mycelial growth and conidial germination.Light and dark alternation reduced mycelial growth,but enhanced sporulation.Among the 95 carbon resources in Biolog FF Microplate,89 ones could be utilized byF.kyushuense.Carbon resources which could not be used by pathogen include N-acetyl-D-galactosamine,N-acetyl-?-D-glucosamine,glucuronamide,sebacic acid,L-serine and adenosine-5’-monophosphate.

flue-cured tobacco;Fusarium kyushuense; biological characteristics

10.3969/j.issn.1004-5708.2014.01.012

S432.1

A

1004-5708（2014）01-0065-06

國家自然科學(xué)基金（31360448）；貴州省科學(xué)技術(shù)基金（黔科合J字[2011]2337號）；中國煙草總公司貴州省公司科技項目（201305，201336）

汪漢成（1982—），副研究員，主要從事植保及煙草微生物學(xué)研究，Tel:0851-4116941，Email:xiaobaiyang126@hotmail.com

夏海乾（1976—），副研究員，主要從事煙草營養(yǎng)方面的研究，Tel:0851-4116941,Email:xiahaiqian@126.com

2013-04-12