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    靶向livin的siRNA對鼻咽癌細胞增殖和凋亡的影響①

    2014-11-27 10:26:38何躍平羅晶晶李祥東
    中國免疫學(xué)雜志 2014年8期
    關(guān)鍵詞:鼻咽癌質(zhì)粒試劑盒

    何躍平 羅晶晶 劉 釗 安 立 李祥東 張 艷

    (遵義醫(yī)學(xué)院第五附屬珠海醫(yī)院耳鼻喉科,珠海 519100)

    livin是近年來發(fā)現(xiàn)的人類凋亡抑制蛋白家族(Inhibitor of apoptosis protein,IAP)新成員,在大多數(shù)正常成人組織不表達,而在多種腫瘤細胞中出現(xiàn)高表達[1,2],與腫瘤抗凋亡效應(yīng)明顯相關(guān)。livin 基因有l(wèi)ivin-α和livin-β兩個異構(gòu)體,分別編碼長度為298和280個氨基酸的蛋白質(zhì),它們的功能略有不同[3]。本實驗利用siRNA技術(shù)沉默livin基因的表達,觀察 livin表達下調(diào)對鼻咽細胞系 CNE-2Z caspase-3的活性、增殖和凋亡的影響,為鼻咽癌基因治療提供新的理論和實驗依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑 鼻咽癌細胞系CNE-2Z由本室保存;RT-PCR試劑盒購自北京博大泰克;質(zhì)粒提取試劑盒、RNA提取試劑盒購自Axygen公司;caspase-3活性檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所;鼠抗人livin單克隆抗體購自Abcam公司;LipofectamineTM2000購自Invitrogen公司;小牛血清購自杭州四季青。

    1.2 livin siRNA表達載體的構(gòu)建 livin siRNA表達載體的構(gòu)建見參考文獻[4]?;趌ivin-β僅比livin-α連續(xù)少54個堿基,即 livin-α包含了 livin-β的全部堿基序列,針對 livin-β(GenBank NM_022161),即 livin-α 和 livin-β 的共有區(qū)設(shè)計靶向livin的siRNA序列。

    1.3 CNE-2Z細胞培養(yǎng)和基因轉(zhuǎn)染 鼻咽癌細胞CNE-2Z用含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)傳代,收集對數(shù)生長期細胞,以2.0×105ml-1接種于 24孔板,過夜培養(yǎng),待細胞長至90%孔底面積時分別以實驗組重組質(zhì)粒(pGPU6/GFP/Neo-livin)、陰性對照質(zhì)粒(pGPU6/GFP/Neo-shNC,無關(guān)序列對照組)轉(zhuǎn)染 CNE-2Z細胞,具體操作按LipofectamineTM2000試劑盒說明書進行,同時以未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的CNE-2Z細胞為空白對照組。轉(zhuǎn)染后24 h于倒置熒光顯微鏡下觀察細胞轉(zhuǎn)染效果,分別于轉(zhuǎn)染后0~72 h收集細胞檢測相關(guān)實驗指標(biāo)。

    1.4 RT-PCR檢測livin沉默后mRNA表達情況將各組細胞濃度調(diào)至6.0×105ml-1接種于6孔板,分別于轉(zhuǎn)染后24、48、72 h提取細胞總RNA。根據(jù)GeneBank提供的livin、β-actin mRNA序列設(shè)計引物(表1)。紫外分光光度計測定RNA濃度,保證反轉(zhuǎn)錄體系中每組所加RNA的量相同。以β-actin作為內(nèi)參照檢測基因表達水平,RT-PCR產(chǎn)物以2.5%瓊脂糖凝膠電泳觀察目的片段,利用AlphaImager 2200軟件進行灰度分析并計算livin mRNA表達抑制率。

    1.5 Western blot檢測livin沉默后蛋白表達情況常規(guī)提取細胞總蛋白,取60 μg蛋白上樣到12%SDS-PAGE凝膠,電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜,分別用抗livin抗體(1∶1 000)和抗 β-actin 抗體(1∶1 000)4℃孵育過夜,再與辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗37℃孵育1 h。TBST洗膜后在暗室X片曝光1 min左右,顯影、定影后成像拍照。

    1.6 caspase-3活性檢測 將CNE-2Z細胞總濃度調(diào)整成1.0 ×105ml-1接種于24 孔板,每孔500 μl培養(yǎng)24 h后進行同步化處理,分別于轉(zhuǎn)染后0、12、24、48 h后收集細胞,依照caspase-3活性檢測試劑盒說明書提取蛋白,以酶標(biāo)儀測定色敏底物DEVD-pNA被蛋白酶分解后的pNA在405 nm波長處的吸光度值。

    表1 PCR引物序列及擴增產(chǎn)物長度Tab.1 Sequence of PCR primers and lengths of amplification products

    1.7 MTT法檢測細胞增殖活性 將CNE-2Z細胞濃度調(diào)整成1.0×104ml-1,接種于96孔培養(yǎng)板,每組設(shè)3個復(fù)孔,每孔加200 μl培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后進行同步化處理,分別于轉(zhuǎn)染后12、24、48、72 h每孔加入 5 mg/ml的 MTT(20 μl/孔),37℃ 孵育 4 h 后棄上清液,每孔加入150 μl二甲基亞砜(DMSO),振蕩裂解10 min待藍色結(jié)晶溶解后,酶標(biāo)儀測定570 nm波長處吸光度(A)值。

    1.8 流式細胞儀檢測細胞凋亡率 收集轉(zhuǎn)染后48 h的各組CNE-2Z細胞,2 000 r/min離心5 min后棄上清,用4℃預(yù)冷的70%乙醇固定。4℃固定18 h后調(diào)整細胞濃度為1.0×106ml-1,取1 ml細胞懸液,PBS洗3次,細胞重懸于1 ml PI染液中,37℃孵育30 min進行流式分析。

    1.9 統(tǒng)計學(xué)分析 數(shù)據(jù)分析用SPSS18.0軟件進行,各組間差異比較采用方差分析,組間百分率采用χ2檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 細胞轉(zhuǎn)染率的觀察 siRNA重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CNE-2Z細胞24 h后,倒置熒光顯微鏡下觀察各組細胞轉(zhuǎn)染率約為60%~70%(圖1)。

    2.2 siRNA抑制CNE-2Z細胞中l(wèi)ivin mRNA的表達 RT-PCR檢測結(jié)果顯示:實驗組pGPU6/GFP/Neo-livin重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞48 h后livin mRNA表達水平明顯受到抑制(圖2,泳道4),與空白組相比抑制率達到64.38%,陰性對照組與空白組相比,livin mRNA表達無明顯變化(P>0.05)。

    圖1 基因轉(zhuǎn)染熒光顯微鏡照片圖(×100)Fig.1 Fluorescent microscope photograph of gene transfection(×100)

    2.3 siRNA抑制CNE-2Z細胞livin蛋白的表達Western blot結(jié)果顯示:實驗組pGPU6/GFP/Neo-livin重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞48 h后livin蛋白表達水平明顯受到抑制(圖3),與空白組相比抑制率達61.43%,而陰性對照組與空白對照組相比livin蛋白表達無明顯差異(P>0.05)。

    圖2 pGPU6/GFP/Neo-livin質(zhì)粒對CNE-2Z細胞livin mRNA表達水平的影響Fig.2 Effect of pGPU6/GFP/Neo-livin plasmid on livin mRNA level in CNE-2Z cells

    圖3 pGPU6/GFP/Neo-livin質(zhì)粒對CNE-2Z細胞livin蛋白表達水平的影響Fig.3 Effect of pGPU6/GFP/Neo-livin plasmid on livin protein level in CNE-2Z cells

    圖4 各組細胞caspase-3的活性檢測Fig.4 Detection of caspase-3 activity in different groups

    2.4 caspase-3酶活性變化 檢測結(jié)果顯示:pGPU6/GFP/Neo-livin轉(zhuǎn)染 CNE-2Z細胞后,caspase-3酶活性隨轉(zhuǎn)染時間的延長逐漸增高,轉(zhuǎn)染后48 h達到最高(圖4),pNA含量為6.68 nmol/L,而空白對照組和陰性對照組則不能有效地激活caspase-3的活性。

    2.5 細胞增殖活性的變化MTT法檢測各組細胞轉(zhuǎn)染后0~72 h生長情況,結(jié)果顯示,與對照組相比,實驗組pGPU6/GFP/Neo-livin重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后能顯

    圖5 pGPU6/GFP/Neo-livin質(zhì)粒對CNE-2Z細胞增殖的影響Fig.5 Effect of pGPU6/GFP/Neo-livin plasmid on cell proliferation of CNE-2Z cells

    表2 各組細胞凋亡率(%)Tab.2 Apoptosis rate of CNE-2Z cells in each group(%)

    圖6 流式細胞儀檢測各組細胞凋亡水平代表圖Fig.6 Representative diagrams of cell apoptosis detected by flow cytometry

    著抑制CNE-2Z細胞的增殖,并呈時間依賴性,抑制率最高達38.7%(P<0.01),而空白組和陰性對照組細胞增殖活性未見改變(圖5)。

    2.6 轉(zhuǎn)染后CNE-2Z細胞凋亡率的變化 轉(zhuǎn)染后48 h,livin特異性siRNA組細胞的凋亡率顯著增加,與空白組和陰性對照組比較差異有顯著性(P<0.01),說明沉默livin的表達可增加細胞的凋亡(表2、圖6)。

    3 討論

    惡性腫瘤細胞凋亡失衡與腫瘤發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)和患者預(yù)后有著密切關(guān)系[5]。抑制IAPs家族成員蛋白表達,誘導(dǎo)腫瘤細胞發(fā)生凋亡,是目前腫瘤靶向治療的一個新的研究方向[6]。livin是近年發(fā)現(xiàn)的人類IAP家族的新成員,與腫瘤有較強的相關(guān)性,可在多種腫瘤細胞中高表達,而在正常分化成熟組織中基本不表達[7]。RNA干擾(RNAi)是近年發(fā)展起來的一種轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默技術(shù),它是由生物體細胞內(nèi)外源性或內(nèi)源性的雙鏈RNA所引起的序列特異性基因沉默現(xiàn)象。與反義寡核苷酸技術(shù)、基因敲除技術(shù)及抗體介導(dǎo)的基因表達沉默技術(shù)相比,RNAi具有特異性強、抑制效率高等優(yōu)點,已被廣泛應(yīng)用于功能基因組學(xué)以及疾病的基因治療等方面[8]。本實驗利用RNAi技術(shù)成功地抑制了CNE-2Z細胞中l(wèi)ivin mRNA和蛋白的表達,抑制率分別為64.38%、61.43%,說明所選擇的siRNA序列具有良好的干擾效率。

    與其他IAP家族成員相似,livin包含1個串聯(lián)的含有半胱氨酸/組氨酸的桿狀病毒IAP重復(fù)區(qū)(Baculovirus IAP repeat,BIR)的結(jié)構(gòu),相鄰的羧基末端含有一個環(huán)指結(jié)構(gòu)。livin的抗凋亡活性就主要依賴于其BIR的結(jié)構(gòu)域。體外實驗證實livin和其下游的caspase-3、caspase-7的相互作用是也依賴于BIR結(jié)構(gòu)域[3]。livin抑制細胞凋亡主要是通過直接抑制凋亡蛋白酶(caspases)而實現(xiàn)的,Vucic等[9]發(fā)現(xiàn)livin可與 caspase-3、caspase-9及 caspase-9前體發(fā)生免疫共沉淀,由此推斷 livin可以通過抑制caspase-3及caspase-9的活性而抑制細胞發(fā)生凋亡,且caspase-3是caspases家族中最重要的凋亡效應(yīng)蛋白,它的激活是凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵。向燕群[10]等人使用抗癌藥拓撲異構(gòu)酶Ⅱ(TopoⅡ)抑制劑吡喃阿霉素(THP)、阿霉素(ADM)誘導(dǎo)鼻咽低分化鱗癌細胞株 SUNE-1細胞凋亡,藥物作用24 h后,SUNE-1細胞凋亡率增加,流式細胞儀檢測livin表達水平增高,這就說明癌細胞表達livin是一種抗凋亡的防御機制。Crnkovic'-Mertens等人[11]利用 RNAi技術(shù)特異性沉默Hela細胞的livin基因,癌細胞凋亡率增加且對抗癌藥物和TNF-α的敏感性增加,且caspase-3,7,9的活性增加。本次實驗研究表明livin表達下調(diào)可以有效地促進細胞中caspase-3活性的增加,實驗組細胞凋亡率達到22.6%,約為空白組細胞凋亡率的6倍。MTT檢測細胞增殖活性結(jié)果顯示,實驗組細胞生長明顯受到抑制,抑制率最高達38.7%。

    本實驗研究證實,livin靶向RNA干擾增強了CNE-2Z細胞caspase-3的活性,增加了鼻咽癌細胞凋亡率,抑制了鼻咽癌細胞的增殖能力,提示livin基因可作為鼻咽癌治療的新靶點。

    [1]Lin JH,Deng G,Huang Q,et al.KIAP,A novel member of the inhibitor of apoptosis protein family[J].Biochem Biophys Res Commun,2000,279(3):820-831.

    [2]Yan B.Research progress on Livin protein:an inhibitor of apoptosis[J].Mol Cell Biochem,2011,357(1-2):39-45.

    [3]Ashhab Y,Allan A,Polliack A,et al.Two splicing variants of a new inhibitor of apoptosis gene with different biological properlies and tissue distribution pattern [J].FEBS Lett,2001,495(1-2):56-60.

    [4]余曉萍,張 艷,朱翠明.Livin的siRNA對胃癌細胞BGC823生長與功能影響的初步研究[J].中華腫瘤防治雜志,2010,17(21):1722-1726.

    [5]Ouyang L,Shi Z,Zhao S,et al.Programmed cell death pathways in cancer:a review of apoptosis,autophagy and programmed necrosis[J].Cell Prolif,2012,45(6):487-498.

    [6]Fulda S,Vucic D.Targeting IAP proteins for therapeutic intervention in cancer[J].Nat Rev Drug Discov,2012,11(2):109-124.

    [7]Kasof GM,Gomes BC.Livin,a novel inhibitor of apoptosis protein family member[J].J Biol Chem,2001,276(5):3238-3246.

    [8]Lambeth LS,Smith CA.Short hairpin RNA-mediated gene silencing[J].Methods Mol Biol,2013,942:205-232.

    [9]Vucic D,Stennicke HR,Pisabarro MT,et al.ML-IAP,a novel inhibitor of apoptosis that is preferentially expressed in human melanomas[J].Curt Biol,2000,10(21):1359-1366.

    [10]向燕群,姚和瑞,郭翔,等.拓撲異構(gòu)酶Ⅱ抑制劑誘導(dǎo)SUNE-1鼻咽癌細胞凋亡的研究[J].中國腫瘤臨床,2005,32(24):1406-1409.

    [11]Crnkovic'-Mertens I,Semzow J,Hoppe-Seyler F,et al.Isoform-specific silencing of the Livin gene by RNA interference defines Livin beta as key mediator of apoptosis inhibition in HeLa cells[J].J Mol Med(Berl),2006,84(3):232-240.

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