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    PIMT對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細胞凋亡的影響①

    2014-11-27 10:26:36虞珊珊孫立山范列英
    中國免疫學(xué)雜志 2014年8期
    關(guān)鍵詞:滑膜質(zhì)粒載體

    張 慧 宗 明 李 牛 虞珊珊 孫立山 范列英

    (上海市東方醫(yī)院同濟大學(xué)附屬東方醫(yī)院,上海 200120)

    前期研究發(fā)現(xiàn)蛋白異天冬氨酰甲基轉(zhuǎn)移酶(Protein isoaspartyl-methyltransferase,PIMT)在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis,RA)滑膜成纖維樣細胞(Fibroblast-like synoviocytes,F(xiàn)LS)中表達下降[1],而PIMT是與細胞增殖、凋亡相關(guān)的甲基轉(zhuǎn)移酶[2,3]。本研究通過將 PIMT 表達載體轉(zhuǎn)染 RAFLS,在RA-FLS細胞中的過表達PIMT,探討PIMT對于RA-FLS細胞凋亡的影響。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 細胞 原代RA-FLS(本室保存)

    1.1.2 載體 pcDNA3.1(-)B-flag(本室保存)。

    1.1.3 引物設(shè)計與合成

    1.1.3.1 PIMT表達質(zhì)粒引物的設(shè)計與合成 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中PIMT基因mRNA序列設(shè)計擴增引物,primer1:5'-TAACTCGAGACCATGCCGGGAGCGCGCAGT-3',primer2:5'-TAAGGATCCCTTCAACCTGGACCACTGCTTTTCTTTATCTG-3',于引物的 5'端加上BamHⅠ和XholⅠ限制性內(nèi)切酶位點和保護堿基,擴增片段長度855 bp,引物由上海Invitrogen公司合成。

    1.1.3.2 PIMT半定量熒光PCR引物設(shè)計與合成

    根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中PIMT基因mRNA序列設(shè)計擴增引物,primer1:5'-TGGGAAAACTGCTGGGCACCG-3',primer2:5'-GGTTTCCGCCTGCAGGACCAA-3'。管家基因 GAPD H引物為primer1:5'-TGACTTCAACAGCGA-3',primer2:5'-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3';引物由上海Invitrogen公司合成。

    1.1.4 主要試劑 RPMI1640培養(yǎng)液、胎牛血清、胰酶(美國 Gibco公司),25 cm2培養(yǎng)瓶,6孔板,10 cm2培養(yǎng)皿(美國Corning公司),總RNA抽提試劑Trizol(美國Invitrogen公司),RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國 Invitrogen公司),SYBR Green PCR試劑盒(大連TaKaRa公司),LipofectamineTM轉(zhuǎn)染試劑(美國Invitrogen公司),抗flag單克隆抗體(美國Sigma公司),羊抗鼠HRP抗體(Abcam公司),Annexin VFITC流式檢測凋亡試劑盒(北京四正柏生物科技有限公司)。

    1.1.5 主要實驗儀器 水平電泳儀(美國Bio-Rad公司),ABI 7300熒光定量 PCR儀(美國 ABI公司),Kubota 3500臺式高速低溫離心機(日本Kubota公司),天能(Tanon)凝膠成像系統(tǒng)(江蘇海門市麒麟醫(yī)用儀器廠),流式分析儀(BD),CO2培養(yǎng)箱(FORMA),倒置式系統(tǒng)顯微鏡(OLYMPUS),超凈臺(BAKER),電熱恒溫水浴箱。

    1.2 方法

    1.2.1 RA-FLS細胞的原代培養(yǎng) 關(guān)節(jié)鏡手術(shù)中取出的滑膜組織用無菌手術(shù)剪剪成1 mm3大小,以5 mm的間距均勻排列于25 cm2培養(yǎng)瓶的培養(yǎng)面上,加入含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液,以濕潤組織為宜,將培養(yǎng)瓶的培養(yǎng)面向上置于37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4~5 h后將培養(yǎng)瓶緩慢翻轉(zhuǎn)平放,靜置培養(yǎng)。24 h后更換培養(yǎng)液,以后每2~3 d更換培養(yǎng)液一次,待FLS成片生長時,去除組織塊繼續(xù)培養(yǎng)。待RA-FLS長至70%~80%時進行細胞傳代。本研究中所用RA-FLS為3~5代細胞。

    1.2.2 PIMT表達質(zhì)粒的構(gòu)建

    1.2.2.1 外周血單個核細胞(PBMC)分離 抽取健康體檢者靜脈血2 ml,EDTA-K2抗凝,用淋巴細胞分離液分離PBMC,加Trizol 1 ml,-20℃保存,用于RNA制備。

    1.2.2.2 抽提總RNA 將上述標(biāo)本按Trizol操作說明書提取總RNA,終體積30 μl。0.8%瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA質(zhì)量有無降解。紫外分光光度儀測定260/280 nm吸光值(OD),確定RNA的含量和純度。

    1.2.2.3 RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA 在薄壁管中配制反應(yīng)溶液: 總 RNA 2 μg,oligo primer(50 μmol/L)1 μl,dNTP mix(10 μmol/L)1μl,加入經(jīng) DEPC 處理的ddH2O 至總體積 10 μl,65℃ 預(yù)變性 5 min。繼續(xù)配制cDNA第一鏈合成反應(yīng)體系:10×RT buffer 2 μl,MgCl2(25 μmol/L)4 μl,DTT(0.1 mol/L)2 μl ,RNAase OUT(40 U/μl)1 μl,SuperScrip Ⅲ RT(200 U/μl)1 μl,至總體積 20 μl。50℃保溫 50 min 后,85℃變性5 min終止反應(yīng),4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2.2.4 PCR擴增目的片段 反應(yīng)體系共50 μl,5 × PS buffer 10μl,dNTP Mix 4 μl,Primer Mix(20 μmol/L)1 μl,cDNA 4 μl,Primer Star 0.5 μl,加ddH2O 至50 μl體積。擴增條件:98℃ 10 s,68℃ 1 min,共42個循環(huán)。

    1.2.2.5 PIMT陽性克隆的制備 PCR產(chǎn)物的純化按說明書操作;純化產(chǎn)物與pcDNA3.1(-)B-flaghrGFP載體進行連接,操作按說明書。常規(guī)制備感受態(tài)大腸桿菌Top10;連接產(chǎn)物全量(10 μl)轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌Top10;PCR篩選鑒定陽性克隆,得到PIMT片段的克隆質(zhì)粒 pcDNA3.1(-)B-flag-PIMT。質(zhì)粒送上海邁普生物公司測序,最終證實PIMT的cDNA片段序列的正確性。抽提、純化重組質(zhì)粒 pcDNA3.1(-)B-flag-hrGFP-PIMT,PCR 擴增檢測質(zhì)粒。

    1.2.3 PIMT表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染RA-FLS 轉(zhuǎn)染前一天種2×106個細胞于6孔板中,置于37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。將2 μg質(zhì)粒 DNA溶于500 μl Opti-Mem無血清培養(yǎng)基中;將5 μl lipo2000溶于500 μl Opti-MEM無血清培養(yǎng)基中,混勻室溫放置5 min。將上述兩管溶液混合,放置30 min后加入6孔板對應(yīng)孔中,4~6 h時換成含有血清的1640培養(yǎng)基。

    1.2.4 PIMT mRNA在RA-FLS細胞中的表達 轉(zhuǎn)染48 h后,收集細胞,抽提細胞 mRNA,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,實時熒光定量PCR檢測PIMT mRNA表達水平。定量PCR反應(yīng)體系如下:2 μl cDNA,引物1和引物 2 各 0.5 μl(20 μmol/L),ddH2O 9 μl,0.5 μl ROX,2 ×SYBR Premix EX Taq 12.5 μl,混勻后置熒光定量PCR儀進行反應(yīng)。反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性30 s,再進行40個循環(huán):95℃ 5 s,60℃ 31 s,最后延伸1個循環(huán):60℃ 1 min,95℃ 15 s。循環(huán)結(jié)束后進行熔解曲線測定。基因表達相對水平計算:PIMT基因相對于管家基因GAPDH的表達水平根據(jù) 2-ΔCt計算,ΔCt=Ct(待測基因)-Ct(GAPDH),各樣品間的模板量平衡采用與上述標(biāo)準(zhǔn)參考樣品間ΔCt值進行校正,RA-FLS細胞中PIMT基因相對于管家基因GAPDH的表達水平最終用2-ΔCt計算公式進行轉(zhuǎn)換,重復(fù)該實驗三次。

    1.2.5 PIMT蛋白在RA-FLS細胞中的表達 轉(zhuǎn)染48 h后,收集細胞,提取細胞總蛋白并定量,Western blot檢測PIMT蛋白表達水平:SDS-PAGE蛋白電泳分離樣品,轉(zhuǎn)膜50 min,室溫封閉2 h,加一抗antiflag(1∶10 000)4℃過夜,用PBST洗滌三次后加二抗(1∶5 000)室溫反應(yīng)30 min,PBST洗滌三次后掃描。

    1.2.6 PIMT對RA-FLS細胞凋亡的影響 用4℃預(yù)冷的PBS洗細胞兩次,用250 μl結(jié)合緩沖液重懸浮細胞,調(diào)節(jié)其濃度為1×105ml-1。取100 μl的細胞懸液于 5 ml流式管中,加入 5 μl的 Annexin V/FITC 和 10 μl 20 μg/ml的碘化丙錠溶液。混勻后于室溫避光孵育15 min。在反應(yīng)管中加入400 μl的PBS,流式細胞儀(FITC)分析。

    1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)采用SPSS16.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析;配對數(shù)據(jù)采用t檢驗,P<0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 PIMT表達質(zhì)粒的構(gòu)建 將PCR產(chǎn)物連接至pcDNA3.1(-)B-flag-hrGFP載體上后,轉(zhuǎn)化大腸肝菌Top10得到重組質(zhì)粒,PCR法和雙酶切鑒定陽性克隆,同時該陽性克隆質(zhì)粒經(jīng)邁普公司測序鑒定,證明序列與Genebank的序列基本一致,但在565 bp處 C→T,經(jīng) BLAST比對,此處為 SNP位點(rs17355457),見圖1。

    2.2 PIMT表達質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染 于轉(zhuǎn)染48 h后收集細胞,半定量熒光PCR檢測RA-FLS細胞mRNA變化情況。正常對照中PIMT mRNA相對于GAPDH的表達水平是0.202拷貝/ml,轉(zhuǎn)染空載體的陰性對照是0.273拷貝/ml,而轉(zhuǎn)染了 pcDNA3.1-PIMT載體的RA-FLS細胞中PIMT mRNA相對于GAPDH的表達水平則是2.657拷貝/ml,與正常對照和陰性對照相比,有約13倍的升高,結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)意義(t=19.287,P <0.01,圖2)。Western blot檢測 PIMT 蛋白變化水平,用抗flag抗體檢測PIMT在RA-FLS中的表達,結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染了pcDNA3.1-PIMT載體的RA-FLS細胞能檢測到抗flag抗體的表達,而空白對照和陰性對照中不能檢測到抗flag抗體的表達(圖3)。

    2.3 PIMT對RA-FLS細胞凋亡的影響 于轉(zhuǎn)染48 h后收集細胞,流式細胞儀檢測細胞凋亡變化情況,與正常對照相比較,轉(zhuǎn)染了PIMT表達載體的細胞凋亡水平升高由5.11%上升至12.74%;與轉(zhuǎn)染空載體的陰性對照相比較,轉(zhuǎn)染表達載體的RA-FLS細胞凋亡水平由12.74%上升至22.59%(圖4),結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)意義(t=4.448,P<0.01)。

    圖1 PIMT表達質(zhì)粒測序結(jié)果(正向,反向)Fig.1 PIMT expression plasmid sequencing results(Forward,Reverse)

    圖2 轉(zhuǎn)染PIMT表達載體后,RA-FLS細胞PIMT mRNA變化(P<0.01)Fig.2 Expression level of mRNA of PIMT changed(P <0.01)

    圖3 轉(zhuǎn)染PIMT表達載體后,Western blot檢測抗flag抗體Fig.3 Western blot analysis for anti-flag after transfected vector of PIMT into RA-FLS

    圖4 轉(zhuǎn)染PIMT表達載體后,RA-FLS細胞凋亡的變化(P<0.01)Fig.4 Apoptosis level of RA-FLS changed after 48 h transfected with expressed plasmid(P<0.01)

    3 討論

    類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎是一種常見的自身免疫病,我國發(fā)病率約為0.3%~0.5%,是造成人群勞動力喪失和致殘的主要疾病之一。RA的基本病理改變是持久反復(fù)發(fā)作的關(guān)節(jié)滑膜慢性增生性非化膿性炎癥,侵入滑膜下軟骨和骨質(zhì),最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形和功能喪失[4]。近年來的研究證明RA-FLS的增殖與凋亡失調(diào)是關(guān)節(jié)滑膜炎性增生,關(guān)節(jié)破化的主要原因之一[5,6]。因此,尋找與 FLS 增殖/凋亡失調(diào)相關(guān)的蛋白質(zhì),并闡明該蛋白質(zhì)在FLS增殖與凋亡失調(diào)中的具體調(diào)節(jié)機制,對研究RA發(fā)病機制和尋找治療靶點具有重要意義。我們前期研究發(fā)現(xiàn),PIMT在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維樣細胞中(RA-FLS)中表達下降,而PIMT是一個與細胞增殖、凋亡相關(guān)的甲基轉(zhuǎn)移酶,因此,本研究通過在RA-FLS細胞中過表達PIMT,探討PIMT對RA-FLS細胞凋亡的影響。

    生理條件下,蛋白質(zhì)中的L-天冬酰胺酰殘基(L-asparaginyl residues)和L-天冬氨酰殘基(L-aspartyl residues)會自發(fā)的脫氨?;虍悩?gòu)化形成異常的L-天 冬 氨 酰(abnormall-isoaspartylresidues,L-isoAsp),這種異常的L-isoAsp在蛋白內(nèi)集聚能改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)并影響蛋白質(zhì)功能[7,8]。PIMT是普遍存在于原核細胞與真核細胞中的修復(fù)酶,在生理條件下能識別并轉(zhuǎn)移S-腺苷-L-甲硫氨酸(S-adenosyl-L-methionine,AdoMet)中甲基基團至異常的L-天冬氨酰(L-isoaspartyl)殘基中的游離羧基上,修復(fù)異常的L-天冬氨酰殘基轉(zhuǎn)變成正常的L-天冬氨酰,并恢復(fù)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能。研究顯示,與正常的小鼠相比較,敲除PIMT基因的小鼠其CD4+T淋巴細胞和脾細胞過度增殖,而將這種小鼠的骨髓移植給正常小鼠,會產(chǎn)生抗DNA抗體和表現(xiàn)典型紅斑狼瘡腎炎的病理變化[9]。而在腫瘤細胞中PIMT基因的缺失也能引起細胞增殖。在小鼠皮質(zhì)神經(jīng)元細胞和COS-1細胞系中,PIMT基因缺失會導(dǎo)致細胞抵御Bax誘導(dǎo)的凋亡[10]。

    本研究通過構(gòu)建PIMT表達質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染RAFLS細胞,發(fā)現(xiàn)PIMT表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至RA-FLS細胞后,PIMT在mRNA水平和蛋白水平均明顯升高,表明PIMT表達載體轉(zhuǎn)染 RA-FLS細胞成功;轉(zhuǎn)染PIMT表達載體的RA-FLS細胞的凋亡水平明顯高于陰性對照RA-FLS細胞,表明PIMT升高會引起RA-FLS細胞凋亡上升,因此PIMT在RA-FLS細胞中表達下降是RA-FLS細胞凋亡減少的重要原因之一,PIMT對RA-FLS細胞增殖/凋亡失調(diào)中有一定的調(diào)節(jié)作用。

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