徐 丹 姜 潮 陳 昱 艾 君 王曉艷 李校堃
(吉林農業(yè)大學生物反應器與藥物開發(fā)教育部工程研究中心,長春 130118)
結核病(Tuberculosis,TB)是由結核分枝桿菌(Mycobacteria tuberculosis,MTB)引起的通過空氣傳播的人獸共患傳染病。據(jù)世界衛(wèi)生組織報道,在2011年,約有870萬名新增結核病例(13%感染了艾滋病病毒)和140萬人死于結核病[1]。結核病已成為我國乃至世界危害最嚴重的疾病之一。1921年,Calmette和Guérin研制出減毒分枝桿菌Bacille Calmette-Guérin(BCG),BCG是目前應用最廣泛的結核分枝桿菌疫苗,但BCG保護力不穩(wěn)定為0~80%,BCG不能提供有效的免疫保護力來抵抗結核分枝桿菌的感染,尤其對處于潛伏期的結核病患者不會產生任何效果[2,3],所以急需一種有效的疫苗來控制結核病的蔓延,目前研究最多的是重組BCG、DNA疫苗和亞單位疫苗。
MPB64蛋白是MTB基因組RD2區(qū)基因編碼的蛋白,分子量約為23 kD,只存在于MTB毒株中,不存在于BCG中[4]。MPB64是MTB培養(yǎng)物濾過蛋白的主要成分之一,占分泌蛋白總量的8%,亦是最早被發(fā)現(xiàn)的MTB復合群特異性抗原,可誘導肺結核患者的淋巴細胞增殖并可產生高水平的IFN-γ,能引起較強的細胞和體液免疫,具有開發(fā)成結核病亞單位疫苗和檢測試劑盒的潛力。本研究在桿狀病毒表達載體系統(tǒng)中表達MPB64,希望獲得具有免疫原性的重組蛋白,為MPB64的表達提供新途徑,為結核病的檢測和亞單位疫苗的研究提供實驗依據(jù)。
1.1 材料
1.1.1 質粒細菌 含有MPB64-His基因序列(昆蟲密碼子優(yōu)化)的pUC57載體、E.coli DH5α菌種均由本實驗室保存;pFastBac載體、E.coli DH10Bac感受態(tài)購自Invitrogen公司。
1.1.2 試劑盒 脂質體轉染試劑盒、Bac-to-Bac表達系統(tǒng)試劑盒、Sf 9昆蟲細胞、Sf-900II無血清培養(yǎng)基購自 Invitrogen;PCR酶、限制性內切酶、DNA Marker 10 000、DNA連接酶購自大連寶生物;質粒提取試劑盒購自北京索萊寶公司;His標簽抗體購自abcom公司;BALB/c小鼠由溫州醫(yī)科大學動物實驗中心提供(18只,雌性,6~8周齡);IFN-γ檢測試劑盒購自上海巧伊生物技術有限公司。
1.2 方法
1.2.1 設計引物 從pUC57-CFP10-ESAT-6-MPB64-His載體中擴增MPB64-His目的基因片段,運用Primer 5.0軟件設計含有BamHⅠ和PstⅠ酶切位點及保護堿基的上游引物和下游引物,通過PCR克隆得到N端含有6個His標簽的MPB64基因,上游引物 5'CGGGATCCATGAGGATAA3',下游引物5'CTGCAGCTAGTGATGGTGATG3'。
1.2.2 PCR反應體系 上下游引物各1 μl,模板質粒 1 μl,ExTaq 酶 0.25 μl,dNTP 4 μl,10 × buffer 5 μl,超純水 37.75 μl,50 μl反應體系。94℃ 預變性 5 min,94℃ 30 s,60℃ 30 s,72℃ 45 s,30 個循環(huán)后72℃延伸8 min。
1.2.3 重組pFastBac-MPB64-His載體的構建PCR獲得的MPB64-His片段和pFastBac質粒分別用BamHⅠ和PstⅠ酶雙酶切并回收需要的片段,目的片段與空載體pFastBac連接后轉化DH5α感受態(tài),挑選單菌落進行PCR和酶切驗證并由華大基因測序,測序正確的單克隆提質粒進行下一步實驗。
1.2.4 重組Bacmid-MPB64-His載體的構建pFastBac-MPB64-His質粒轉化含有Bacmid載體的DH10Bac感受態(tài)(方法根據(jù)說明書),轉化后的DH10Bac 菌涂布在五抗(K 50 μg/ml,T 10 μg/ml,G 7 μg/ml,IPTG 40 μg/ml,X-gal 100 μg/ml)固體培養(yǎng)基的平皿上,37℃倒置培養(yǎng)48 h,藍白斑鑒定陽性菌落,挑取單菌落在五抗平皿中劃線培養(yǎng),至整個平皿中只有白色菌落,挑取單菌落利用Bacmid中的M13片段和目的基因片段兩端引物進行PCR鑒定。
1.2.5 重組桿狀病毒的制備 取兩份100 μl的SF-900Ⅱ培養(yǎng)基,一份加入 8 μl重組 Bacmid-MPB64-His質粒,另一份加入6 μl Cellfectin Reagen試劑,將兩份溶液混合均勻并室溫孵育45 min,6孔板加入對數(shù)生長期的Sf 9細胞,每孔1.0×106個,27℃靜止培養(yǎng)1 h,輕輕移去培養(yǎng)基,加入上述混合物,27℃靜止培養(yǎng)4 h,移去上述混合溶液,加入2 ml培養(yǎng)基,濕盒中27℃培養(yǎng)72 h后可以看到細胞發(fā)生病變,當發(fā)生病變的細胞大于50%時,收細胞和培養(yǎng)基,800 r/min離心5 min,取上清即是P1代病毒,P1代病毒加入2%胎牛血清4℃避光儲存。P1代病毒連續(xù)轉染細胞3次獲得P4代病毒。
1.2.6 測定P4代病毒滴度 對數(shù)生長期的細胞加入6孔板,每孔2 ml 5×105個/ml,貼壁培養(yǎng)過夜,P4代病毒用培養(yǎng)基稀釋成103~108,移去上清液,每孔加病毒稀釋液1 ml,27℃培養(yǎng)1 h后,移去病毒液,將提前在40℃保溫的4%低熔點瓊脂和1.3×的培養(yǎng)基按1∶3比例混合,并迅速加入6孔板,自然凝固后置于27℃濕盒中靜止培養(yǎng)10~15 d,至每孔中的蝕菌斑數(shù)連續(xù)2 d不變,選擇蝕斑數(shù)在3~20個的孔,病毒滴度的計算公式:滴度(pfu/ml)=每孔蝕斑數(shù)×稀釋倍數(shù)/1 ml。
1.2.7 轉染條件的優(yōu)化 用P4代病毒轉染對數(shù)生長期細胞,細胞密度2×106個/ml,27℃搖床100 r/min 培養(yǎng),不同時間取樣(24、48、60、72、84、96、108、120 h),并取同樣細胞設不同感染復數(shù)(2,3,4,5,6)組,96 h后取樣,SDS-PAGE電泳后,取膠300 mA轉膜75 min,5%脫脂奶粉室溫封閉1 h,2.5%脫脂奶粉2 000倍稀釋anti-his單克隆抗體,室溫孵育2 h,TBST洗滌3次,每次5 min,3 000倍稀釋二抗,室溫孵育1 h,TBST稀釋3次,曝光。
1.2.8 蛋白純化 A液為20 mmol/L PB,pH8.0;B液為20 mmol/L PB+500 mmol/L NaCl,pH8.0;C 液為20 mmol/L PB+400 mmol/L咪唑,pH8.0。收集細胞培養(yǎng)液,調pH至8.0上Q柱100%A液平衡,16%B液沖洗雜蛋白,30%B液洗脫目的蛋白,100%B液再生Q柱。Q柱收集液上Ni柱,A液平衡,7.5%C液沖洗雜蛋白,50%C液洗脫目的蛋白,100%C液再生Ni柱。純化后蛋白超濾離心除鹽,經SDS-PAGE電泳后,利用灰度分析測定純度,BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測蛋白濃度,計算蛋白表達量。
1.2.9 免疫小鼠 BALB/c小鼠隨機分為三組,每組6只。空白對照組腹腔注射生理鹽水,陽性對照組注射卡介苗BCG,實驗組采用腹腔注射MPB64蛋白免疫BALB/c小鼠3次,每只每次0.05 mg(生理鹽水組0.2 ml/只),每次間隔2周,每次免疫后第3天斷尾取血,血清儲存在-80℃?zhèn)溆谩?/p>
1.2.10 血清中抗體滴度的檢測 BCG和純化的蛋白MPB64分別在碳酸鹽包被緩沖液中稀釋到1.0 μg/ml,100 μl/孔包被酶標板 4℃過夜,PBST 洗3次,分別加入PBS稀釋的血清100 μl/孔,20倍稀釋起始,依次倍比稀釋12個濃度梯度,空白孔用PBS代替,37℃孵育2 h,PBST 洗3次,每孔100 μl加5 000倍稀釋的二抗,37℃孵育1 h,PBST洗3次,加底物顯色,酶標儀檢測490 nm波長下的吸光值。
1.2.11 脾臟細胞分泌IFN-γ的檢測 BALB/c小鼠免疫后第9周處死,無菌條件下分離脾臟細胞,每孔40萬個細胞鋪96孔板。每孔加入10 μg培養(yǎng)基稀釋的MPB64蛋白,空白對照加入等量培養(yǎng)基,37℃培養(yǎng)72 h后取上清,ELISA方法檢測血清中IFN-γ濃度,實驗步驟按照說明書。
1.2.12 重組蛋白MPB64對脾臟細胞的增殖活性
BALB/c小鼠免疫后第9周處死,無菌條件下分離脾臟細胞,每孔40萬個細胞鋪96孔板。稀釋成不同濃度的重組蛋白給藥,最高濃度100 μg/孔,連續(xù)2倍稀釋10個梯度。以 PBS作為空白對照。37℃培養(yǎng)72 h后每孔加25 μl MTT,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,小心的除去上清,每孔加120 μl DMSO,震蕩10 min至結晶溶解。在630 nm和570 nm雙波長下測定吸光度,計算重組蛋白對脾臟細胞的增殖活性。
2.1 Bacmid-MPB64-His表達載體構建示意圖 桿狀病毒表達載體Bacmid-MPB64-His的構建,如圖1所示??寺〉腗PB64-His基因插入到桿狀病毒轉移載體pFastBac的BamHⅠ和 PstⅠ酶切位點之間。重組轉移載體pFastBac-MPB64-His轉染DH10Bac感受態(tài)細胞,并在幫助質粒的作用下與DH10Bac中的表達載體Bacmid在mini-Tn7位點發(fā)生轉座,獲得重組MPB64-His質粒。
2.2 目的基因的PCR擴增 MPB64-His基因包括MPB64的687 bp和其后的His標簽以及加兩端的酶切位點共744 bp,結果與預期一致,如圖2所示。
2.3 重組pFastBac-MPB64-His質粒的雙酶切驗證提取pFastBac-MPB64-His質粒,用 BamHⅠ和 PstⅠ雙酶切,酶切大小片段與預期結果一致,如圖3所示。
2.4 重組Bacmid-MPB64-His載體的PCR驗證提取Bacmid-MPB64-His質粒,以MPB64-His的上游引物和M13的下游引物做PCR驗證,電泳結果與預期值1 223 bp一致,如圖4所示。
圖1 桿狀病毒表達載體的構建Fig.1 Construction of recombinant baculovirus expression vector
圖2 PCR擴增MPB64-His基因Fig.2 PCR product of MPB64-His gene
2.5 昆蟲細胞感染病毒后的形態(tài)學鑒定 重組Bacmid-MPB64-His載體在轉染試劑的介導下轉染對數(shù)生長期的昆蟲細胞,昆蟲細胞感染病毒72 h后,在顯微鏡下觀察形態(tài)變化,細胞停止生長分裂,細胞內有粒狀物出現(xiàn),細胞表面出芽,出泡,部分細胞裂解,如圖5所示。
圖3 pFastBac-MPB64-His雙酶切鑒定Fig.3 Identification of recombinant plasmid pFastBac-MPB64-His
圖4 PCR鑒定重組桿狀病毒DNAFig.4 Identification of recombinant baculovirus DNA by PCR
2.6 蛋白的表達 P3代病毒轉染對數(shù)生長期的昆蟲細胞,72 h后收集上清經15%SDS-PAGE電泳顯示在23 kD有蛋白表達,如圖6所示。P4代病毒轉染對數(shù)生長期的昆蟲細胞,收集上清做Western blot鑒定,證明細胞感染病毒48 h后有蛋白表達,96 h時蛋白表達量最高,感染復數(shù)(MOI)為4時蛋白收獲最高,如圖7所示。
2.7 蛋白的純化 收集上清上樣于Q柱,洗脫樣品在SDS-PAGE電泳顯示目的條帶在含0.15 mol/L NaCl的PB緩沖液中洗脫,洗脫樣品上樣于Ni親和層析柱,用含咪唑的PB緩沖液洗脫,樣品經12%SDS-PAGE電泳顯示目的蛋白在含0.2 mol/L咪唑的PB緩沖液中洗脫。灰度分析測定蛋白純度為91%。洗脫樣品除鹽后測定蛋白濃度,計算上清中蛋白收量為35 mg/L,如圖8所示。
2.8 血清中抗體效價測定 MPB64免疫組血清中抗體效價的測定在20~5 120倍間呈S形曲線,最佳稀釋倍數(shù)為2 000倍。MPB64免疫組明顯高于BCG對照組,結果如圖9所示。
圖5 正常及感染后的Sf 9細胞形態(tài)Fig.5 Normal Sf 9 and Sf 9 cells infected after 72 h
圖6 病毒感染細胞后的蛋白表達Fig.6 Protein expression after virus infected cells
圖7 Western blot檢測不同時間和感染復數(shù)表達蛋白表達情況Fig.7 Detection of expression of recombinant MPB64-His protein in different infection time and various MOI infection by Western blot
圖8 MPB64蛋白純化結果Fig.8 Purification of MPB64
圖9 血清抗體的滴度Fig.9 Serum antibody titer
2.9 脾臟細胞分泌IFN-γ的檢測 免疫后的第9周,取小鼠脾臟細胞培養(yǎng)在96孔板,加入10μg蛋白MPB64刺激,72 h后培養(yǎng)基中IFN-γ的含量為35.75 pg/ml,明顯高于空白對照組的1.28 pg/ml,如圖10所示。
圖10 培養(yǎng)基上清中IFN-γ的含量Fig.10 Supernatant levels of IFN-γ
圖11 MPB64促脾臟細胞增殖研究Fig.11 MPB64 promoted splenic lymphocytes cells proliferation
2.10 重組蛋白對脾臟細胞的增殖活性驗證 酶標儀檢測570 nm波長下的吸光值,數(shù)據(jù)如圖11所示,由數(shù)據(jù)顯示重組蛋白對免疫過的小鼠脾臟細胞有明顯的促增殖作用,在蛋白濃度0.2~100 μg/ml之間呈劑量依賴性。
自1990年以來,TB已經受到世界各國的重視,每年新增病例以及死亡人數(shù)持續(xù)減少,但由于耐藥TB的出現(xiàn)以及結核病例感染艾滋病毒,使得TB控制的進展極為緩慢。我國在全球22個TB重災區(qū)中僅次于印度排名第二[5,6]。TB的治療費用高,且因耐藥甚至耐多藥株的出現(xiàn)使TB的多種藥物作用降低,尤其是耐多藥TB的治療副作用較大,治療周期延長。
BCG仍是目前預防TB唯一可用的疫苗。BCG的制備和傳代過程中丟失了部分與保護力相關的基因。接種BCG可顯著降低兒童TB的發(fā)病率和死亡率,但對成人的免疫效果極不穩(wěn)定,保護力為0~80%,而且BCG仍存在一定毒力,最近研究顯示BCG與臨床致病結核分枝桿菌有很大不同,BCG對流行的臨床菌株北京株缺乏有效作用[7]。
亞單位疫苗與BCG相比,具有組分明確、生產周期短、價格低廉、無毒安全等優(yōu)點,已受到國內外眾多學者的青睞,目前已知的保護性抗原有MTB早期分泌蛋白ESAT6、CFP10、MPB64和Ag85B復合物等[8]。
桿狀病毒表達載體系統(tǒng)(BEVS)是1983年由Smith等[9]建立,具有蛋白表達水平高、周期短、對目的蛋白有翻譯后修飾作用等優(yōu)點[10,11]。它幾乎可以表達任何生物(從細菌到人體組織)的基因產物和進行任何細胞定位(細胞內、細胞外周質),已廣泛用于生物制藥、基因工程及疫苗的研究及生產,其中在該系統(tǒng)中生產的流感疫苗和豬瘟亞單位疫苗具有良好的效果[12,13]。
本實驗在桿狀病毒表達載體系統(tǒng)成功地表達了結核分枝桿菌蛋白MPB64并進行純化,又進一步驗證重組蛋白MPB64的免疫原性,證明重組蛋白可以刺激BALB/c小鼠產生抗體,提高BALB/c小鼠血清中IFN-γ的含量。IFN-γ可激活巨噬細胞,增強巨噬細胞殺傷能力,抑制MTB生長,最終產生抗TB的保護效應。
目前,我國結核感染皮試診斷及流行病學調查主要采用PPD(結核桿菌精致純蛋白衍生物)皮試。但PPD中存在致病性分枝桿菌、環(huán)境中的分枝桿菌及BCG所共有的抗原,因而不能區(qū)分BCG接種、非致病性分枝桿菌感染和結核桿菌感染,特異性和敏感性均不理想。因MPB64只存在于致病性結核分枝桿菌,不存在于作為疫苗的BCG中,純化后的重組蛋白除可作為疫苗外,可用于制備檢測試劑盒,檢測接種人群的抗體表達量。對比PPD檢測可以區(qū)別BCG免疫和MTB感染。本課題組在以上實驗的基礎之上,將繼續(xù)對MPB64免疫原性進一步檢測,并對重組蛋白MPB64進行保護力的探究和嘗試,利用重組蛋白MPB64對TB檢測進行開發(fā)。
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