孕婦血清妊娠相關(guān)蛋白A魯米諾氧通道免疫測定方法的建立①

郝穎新 侯麗英 周宇捷 張?jiān)孪?李會(huì)強(qiáng)

(天津醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院臨床免疫學(xué)教研室，天津 300203)

妊娠相關(guān)蛋白A(Pregnancy associated plasm a protein A，PAPP-A)是一種由胎盤合體滋養(yǎng)層細(xì)胞和蛻膜產(chǎn)生的，與妊娠相關(guān)的大分子糖蛋白。孕早期在母體外周血中即可檢測到PAPP-A，且隨孕周增加，其水平會(huì)持續(xù)上升，孕足月時(shí)達(dá)到高峰［1，2］。目前，國際上普遍認(rèn)為，PAPP-A是孕早期篩查唐氏綜合征的敏感指標(biāo)［3］，而且近年來，有研究發(fā)現(xiàn)，PAPP-A對(duì)許多妊娠并發(fā)癥也有一定的預(yù)測能力，包括妊娠期高血壓疾病、胎兒宮內(nèi)生長受限、出生低體重兒及妊娠期糖尿病等［4-6］。因此，它是一個(gè)重要的產(chǎn)前篩查指標(biāo)。

目前檢測PAPP-A的最常用方法是時(shí)間分辨熒光分析法(Time resolved fluoroimmunoassay，TRFIA)，但其操作繁瑣，需反復(fù)洗板，耗時(shí)長。魯米諾氧通道免疫測定(Luminescent oxygen channeling immunoassay，LOCI)技術(shù)問世于上世紀(jì)90年代，具有均相、免清洗高檢測性能等優(yōu)點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)利用該方法建立了定量檢測血清PAPP-A的方法，并對(duì)檢測性能進(jìn)行了初步評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 血清標(biāo)本 選自天津市中心婦產(chǎn)科醫(yī)院孕早期(孕9～13+6周)正常產(chǎn)檢孕婦血清標(biāo)本50份及健康體檢男性混合血清。

1.2 主要試劑和儀器 受體微球和鏈霉親和素化的供體微球購自上海博陽生物科技有限公司;兔抗人PAPP-A多克隆抗體和鼠抗人PAPP-A單克隆抗體購自英國Abcam公司;長臂活化生物素(NHS-LCBiotin)購自美國Pierce公司;96孔發(fā)光微孔板和光激化學(xué)發(fā)光檢測儀購自上海博陽生物科技有限公司。

1.3 受體微球包被 取受體微球，按照參考文獻(xiàn)［7］的方法，用兔抗人PAPP-A多克隆抗體包被，調(diào)節(jié)受體微球濃度為1 mg/ml，避光保存于4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 生物素標(biāo)記 參照產(chǎn)品說明書，將活化生物素溶于二甲基甲酰胺(DMF)中，按照生物素與鼠抗人PAPP-A單克隆抗體的摩爾比為20∶1的比例將生物素緩慢、逐滴加入抗體溶液中，室溫反應(yīng)1 h;用0.01 mol/L PBS溶液于4℃透析24 h去除游離生物素，分裝，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 標(biāo)準(zhǔn)品的配制 取PAPP-A純品，用含20%滅活小牛血清0.1 mol/L、pH7.8的Tris-HCl緩沖液配制成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液:0、40、160、800、3 200、8 000 mU/L，并利用質(zhì)控血清進(jìn)行校準(zhǔn)，分裝后－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 檢測步驟 向微孔板中依次加入50 μl生物素化抗體、10 μl待測樣品、50 μl受體微球，37℃ 孵育15 min，避光條件下再加入140 μl感光微粒，37℃孵育8 min后用化學(xué)發(fā)光檢測儀檢測光信號(hào)，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，光信號(hào)強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，用四參數(shù)擬合方式繪制PAPP-A濃度-光信號(hào)強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)曲線，并獲得數(shù)學(xué)函數(shù)方程，根據(jù)光信號(hào)強(qiáng)度通過數(shù)學(xué)函數(shù)計(jì)算待測標(biāo)本中PAPP-A的濃度。

1.7 檢測性能評(píng)價(jià)

1.7.1 靈敏度 以零參考值標(biāo)準(zhǔn)品當(dāng)做樣品重復(fù)檢測20次，計(jì)算其均值及標(biāo)準(zhǔn)差。以其測定值的均值加上兩倍的標(biāo)準(zhǔn)差所得信號(hào)值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算得其分析靈敏度;將低值標(biāo)本倍比稀釋后重復(fù)測定10次，當(dāng)CV＞20%時(shí)所對(duì)應(yīng)的濃度值，即為該方法功能靈敏度。

1.7.2 精密度 取孕早期(孕9～13+6周)正常產(chǎn)檢孕婦的血清配制成高、中、低值的待測樣本，分裝后－20℃冷凍保存。每個(gè)濃度的標(biāo)本分別連續(xù)測定10次計(jì)算各濃度批內(nèi)的均值、標(biāo)準(zhǔn)差及變異系數(shù)(CV);每個(gè)濃度每天測定一次，連續(xù)測定10 d，計(jì)算各濃度日間的均值、標(biāo)準(zhǔn)差及CV。

1.7.3 添加回收試驗(yàn) 將健康男性體檢者血清分為三份，分別向其中兩份加入等體積不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，添加濃度分別是200、2 000 mU/L，另一份加入同體積但無PAPP-A的基質(zhì)，用本試驗(yàn)建立的方法檢測各樣品的濃度值，并按照下列公式計(jì)算回收率:回收率(%)=(分析樣品測定濃度－基礎(chǔ)樣品測定濃度)/加入濃度×100%。

1.7.4 干擾性檢測 主要通過干擾試驗(yàn)評(píng)價(jià)，分別向100 μl低值血清和高值血清中加入濃度為210 μmol/L的膽紅素、5 g/L的血紅蛋白、15 mmol/L的甘油三酯各50 μl，對(duì)照樣本添加相同體積但無PAPP-A的基質(zhì)，用本試驗(yàn)建立的方法檢測各樣品的濃度值，并按照下列公式計(jì)算干擾率:干擾率(%)=(基礎(chǔ)樣品的測定濃度－分析樣品的測定濃度)/基礎(chǔ)樣品的測定濃度×100%。

1.7.5 Hook效應(yīng) 用BASE稀釋液將PAPP-A標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成 10 個(gè)濃度值，20、40、80、160、400、800、1 600、3 200、4 000、8 000(mU/L)，每個(gè)濃度值重復(fù)測定4次，計(jì)算各濃度值均數(shù)。

1.7.6 方法學(xué)比較 分別用本實(shí)驗(yàn)建立的方法和時(shí)間分辨熒光分析法檢測50例臨床標(biāo)本的PAPP-A含量，以時(shí)間分辨熒光分析法測定值為橫坐標(biāo)，以本實(shí)驗(yàn)建立方法測定值為縱坐標(biāo)，繪制散點(diǎn)圖，對(duì)兩種測定方法所得數(shù)據(jù)做相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 測定方法的建立 選用1∶100、1∶200、1∶300稀釋的受體微球(已包被)分別與1∶500、1∶1 000、1∶2 000稀釋的生物素化抗體進(jìn)行組合，然后對(duì)最高標(biāo)準(zhǔn)品濃度和零值標(biāo)準(zhǔn)品濃度進(jìn)行測定，通過棋盤滴定，結(jié)果顯示最高標(biāo)準(zhǔn)品光信號(hào)強(qiáng)度與零值標(biāo)準(zhǔn)品光信號(hào)強(qiáng)度比值(P/N)在5 μg/ml受體球與5.86 μg/ml稀釋度生物素化抗體組合達(dá)到最大值，本實(shí)驗(yàn)最適合的生物素化抗體濃度為5.86 μg/ml(1∶500稀釋)，最適的受體球濃度是5 μg/ml(1∶200稀釋)。標(biāo)準(zhǔn)品劑量-反應(yīng)曲線如圖1，數(shù)學(xué)模型如下:y=(51 378.13－43.97)/［1+(x/6695.54)－0.986］+43.97。

2.2 方法學(xué)評(píng)價(jià)

2.2.1 靈敏度利用本實(shí)驗(yàn)建立的方法檢測所得PAPP-A的分析靈敏度為2.8 mU/L，功能靈敏度為4.6 mU/L。

2.2.2 精密度 利用本實(shí)驗(yàn)建立的方法檢測PAPP-A低、中、高值混合定值血清所得結(jié)果，顯示該方法的批內(nèi)變異系數(shù)及批間變異系數(shù)均＜10% 。測定結(jié)果見表1。

2.2.3 添加回收試驗(yàn) 利用本實(shí)驗(yàn)建立的方法檢測上述分析樣品的濃度200、5 000 mU/L，平均回收率分別為100.3%、96.7%。

2.2.4 干擾性檢測 利用本實(shí)驗(yàn)建立的方法檢測上述分析樣品，血紅蛋白、總膽紅素和甘油三酯的干擾率見表2。

圖1 PAPP-A劑量-反應(yīng)曲線Fig.1 Standard curve for PAPP-A

表1 精密度測定結(jié)果Tab.1 Precision of LOCI kit

表2 干擾率測定結(jié)果Tab.2 Specificity of LOCI kit

2.2.5 Hook效應(yīng) 本檢測方法測定PAPP-A濃度在0～8 000 mU/L范圍內(nèi)未見Hook效應(yīng)，見圖2。

2.2.6 與時(shí)間分辨熒光分析法的比較 由線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)顯示，本實(shí)驗(yàn)建立的方法與時(shí)間分辨熒光分析法有較好的相關(guān)性，回歸方程為y=0.970x+71.85，r2=0.989，相關(guān)曲線見圖3。比較兩種方法的檢測性能(表3)，可以看出兩者無顯著差別。時(shí)間分辨熒光分析法的檢測性能數(shù)據(jù)來自于PerkinElmer公司生產(chǎn)的PAPP-A試劑盒說明書。

圖2 PAPP-A LOCI Hook實(shí)驗(yàn)檢測信號(hào)值Fig.2 Hook experiment signal value of PAPP-A

圖3 LOCI法與時(shí)間分辨熒光分析法的相關(guān)性Fig.3 Linear correlation between LOCI and TRFIA

表3 LOCI法與TRFIA法的性能比較Tab.3 Comparison of LOCI kit and TRFIA kit

3 討論

PAPP-A是與妊娠相關(guān)聯(lián)的一種大分子糖蛋白，測定孕婦血清PAPP-A含量變化在篩查異常胎兒方面得到國內(nèi)外學(xué)者的證實(shí)和重視。當(dāng)前檢測PAPP-A的方法主要有酶聯(lián)免疫測定法［8］和時(shí)間分辨熒光分析法［9］，最常用的是時(shí)間分辨熒光分析法，此方法雖然準(zhǔn)確性和特異性較高，但是孕婦血清PAPP-A含量高，標(biāo)本均需要稀釋后檢測，增加了操作步驟，容易產(chǎn)生誤差，同時(shí)實(shí)驗(yàn)需要兩次孵育及洗板過程，耗時(shí)2.5 h以上，產(chǎn)檢孕婦不能當(dāng)天獲得篩查結(jié)果，給臨床帶來了不便，且利用該方法開發(fā)的進(jìn)口試劑盒成本較高，不適合在基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)推廣使用。

魯米諾氧通道免疫測定(Luminescent oxygen channeling immunoassay，LOCI)技術(shù)是一種通過化學(xué)發(fā)光檢測微粒間的結(jié)合，進(jìn)而檢測分析物含量的方法。最初是由 Ullman等［10］在 1994年報(bào)道，并由PerkinElmer公司完成商品化。該技術(shù)原理是感光微粒在680 nm的光照下激發(fā)產(chǎn)生單線態(tài)氧，單線態(tài)氧在極短距離內(nèi)(＜200 nm)擴(kuò)散至發(fā)光微粒，與其中的發(fā)光物質(zhì)反應(yīng)，即可產(chǎn)生560～580 nm的化學(xué)發(fā)光，根據(jù)檢測到的光信號(hào)強(qiáng)度定量被檢測物的濃度。該技術(shù)以其獨(dú)特的檢測方法，實(shí)現(xiàn)了均相、免洗和高通量檢測，徹底避免了清洗和分離所帶來的誤差［11，12］。國內(nèi)已有學(xué)者利用此項(xiàng)技術(shù)建立了促甲狀腺激素、胰島素、絨毛膜促性腺激素等多項(xiàng)微量物質(zhì)的檢測方法［13-15］。

我們建立的血清PAPP-A的LOCI檢測方法，其分析靈敏度為2.8 mU/L，功能靈敏度為4.6 mU/L;回收實(shí)驗(yàn)的回收率為96.7%～100.3%，符合臨床檢測回收率在90%～110%的要求;批內(nèi)精密度與批間精密度分別為5.91%～7.94%和6.14%～9.69%，均小于10%，說明本法有較好的重復(fù)性;特異性分析中各干擾物的干擾率均＜10%，說明本法有較強(qiáng)的抗溶血、黃疸及脂血的干擾;本實(shí)驗(yàn)有較寬的線性范圍(2.8 mU/L～8 000 mU/L)，當(dāng)PAPP-A濃度高達(dá)8 000 mU/L時(shí)無Hook效應(yīng);本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與時(shí)間分辨熒光分析法的檢測結(jié)果有很好的相關(guān)性。

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本實(shí)驗(yàn)初步建立的基于LOCI技術(shù)檢測PAPP-A的方法，具有較好的檢測性能，與其他試劑盒測定結(jié)果之間有較好相關(guān)性，且操作簡便，大大縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間，有極大的臨床應(yīng)用潛力，下一步可繼續(xù)進(jìn)行大樣本量實(shí)驗(yàn)，建立不同孕周PAPP-A的中位數(shù)，為不同孕周正常值參考范圍提供依據(jù)，有望替代同類進(jìn)口PAPP-A檢測試劑盒。

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