大籽蒿花粉過敏原的分離、鑒定與純化①

李興永 肖小軍 孫宏治 何韶衡 楊平常 劉志剛

(遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院，錦州 121000)

據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)報(bào)道變態(tài)反應(yīng)性疾病(過敏性疾病)是當(dāng)前世界性的重大衛(wèi)生學(xué)問題，此類疾病包括過敏性哮喘、過敏性鼻炎、過敏性皮炎等，是臨床常見病、多發(fā)?。?，2］?；ǚ凼且环N重要的致敏原，且在世界范圍內(nèi)花粉過敏性疾病的發(fā)病率不斷增加［3］。近年的花粉調(diào)查顯示，蒿屬花粉仍為中國北方地區(qū)夏秋季最重要的致敏花粉［4-6］，由于蒿屬花粉種類繁多且具有地區(qū)差異性，因此對蒿屬花粉過敏原有必要進(jìn)行深入研究。大籽蒿花粉是我國蒿屬花粉中常見且致敏性較強(qiáng)的一種，但有關(guān)大籽蒿花粉主要過敏原成分的分析鑒定未見報(bào)道。本研究通過SDS-PAGE、Western blot和離子交換層析對大籽蒿花粉過敏原進(jìn)行分離、鑒定與純化，為臨床過敏性患者的診斷及治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 大籽蒿花粉采自遼寧錦州市郊區(qū)，過敏性患者及正常人血清由遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院檢測并采集，在深圳大學(xué)醫(yī)學(xué)院過敏反應(yīng)與免疫學(xué)研究所保存?zhèn)溆?，過敏性患者血清均為蒿屬花粉皮膚點(diǎn)刺試驗(yàn)陽性患者的血清。

1.2 主要儀器與試劑 垂直電泳槽、轉(zhuǎn)膜電泳槽(Model 1 000/500)、凝膠成像及分析系統(tǒng);亞甲基雙丙烯酰胺(Bis)、過硫酸銨(AP)、四甲基乙二銨(TEMED)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、聯(lián)苯二胺(DAB)為AMRESCO公司產(chǎn)品;上樣緩沖體系、蛋白Marker為MBIFermentas公司產(chǎn)品;硝酸纖維膜(NC膜)、透析帶、生物素標(biāo)記的IgE二抗、鏈霉親和素(HRP)購自 Sino-American Biotec;DEAE-Cellulose DE-52為Amersham Pharmacia公司產(chǎn)品。其余均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.3 大籽蒿花粉粗提液的提取 花開季節(jié)收集花粉，取10 g大籽蒿花粉，用液氮充分研磨成粉末，加丙酮浸泡脫脂脫色，去丙酮風(fēng)干后用PBS溶液充分溶解，4℃攪拌過夜，然后12 000 r/min，4℃，離心15 min，取上清，重復(fù)2次，將上清液過0.45 μm濾膜，冷凍干燥存儲備用。

1.4 大籽蒿花粉粗提液的SDS-PAGE用SDSPAGE體系分離大籽蒿草花粉粗提液蛋白組分，并測定其分子量。分離膠為12%，濃縮膠為5%，考馬斯亮藍(lán)R-250染色液染色，脫色后用凝膠成像及分析系統(tǒng)拍照并分析其分子量。

1.5 大籽蒿花粉粗提液的免疫學(xué)特性鑒定 取備用的蒿屬花粉過敏患者和非蒿屬花粉過敏正常人血清各11份，進(jìn)行Western blot檢測。實(shí)驗(yàn)步驟:用Bio-Rad轉(zhuǎn)移槽將凝膠中的蛋白條帶轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上，TBS洗滌2次，5 min/次，將膜用3%BSA封閉液封閉(4℃冰箱過夜);倒去封閉液，TBST洗膜3 次，5 min/次;加入1%BSA-TBST 5∶1稀釋的一抗，37℃孵育2 h，倒去一抗，同上洗膜3次后加入2 000∶1稀釋的二抗-生物素，室溫孵育2 h，倒去二抗，同上洗膜3次后加入5 000∶1稀釋的鏈酶親和素-HRP，室溫孵育2 h，同上洗膜5次，DAB顯色，拍照并分析其Mr。

1.6 大籽蒿花粉粗提液的離子交換層析與檢測大籽蒿花粉提取液冷凍干燥后用0.02 mol/L Tris-HCl(pH7.2)緩沖液透析12 h并過0.45 μm濾膜備用。DE-52離子交換層析柱以0.02 mol/L(pH7.2)的Tris-HCl緩沖液充分平衡，待穿透峰后的基線走平后上樣，改用洗脫緩沖液(0.5 mol/L NaCl、0.02 mol/L Tris-HCl)進(jìn)行線性離子梯度洗脫，用EP管收集各峰液，并進(jìn)行 SDS-PAGE、Western blot，拍照并確定各峰收集液中蛋白的免疫活性。

2 結(jié)果

2.1 大籽蒿花粉粗提液的SDS-PAGE結(jié)果 大籽蒿花粉粗提液經(jīng)SDS-PAGE可見20多種蛋白條帶(圖1)，主要集中在10～16 kD和25～70 kD之間，其中分子量(Mr)為62、57、38、29、25、14 kD 等 6 個條帶蛋白含量最豐富。

2.2 大籽蒿花粉粗提液的Western blot結(jié)果 11例蒿屬花粉過敏患者的血清進(jìn)行免疫印跡檢測，均有陽性反應(yīng)條帶出現(xiàn)，其中Mr 62 kD和16 kD的過敏原與過敏患者血清特異性IgE結(jié)合率最高(均大于50%)，為其主要過敏原(圖2);而無蒿屬花粉過敏的正常人血清呈陰性反應(yīng)，未見陽性反應(yīng)條帶。

2.3 大籽蒿花粉過敏原的純化

2.3.1 花粉過敏原的離子交換層析結(jié)果 用DE-52離子交換層析緩沖液透析的大籽蒿花粉粗提液上柱?？梢姶笞演锘ǚ厶崛∫褐饕?個峰。見圖3。

2.3.2 各峰SDS-PAGE和Western blot結(jié)果 分析表明，大籽蒿花粉提取液經(jīng)離子交換層析后，其蛋白主要分布在Ⅰ～Ⅴ峰。見圖4。免疫印跡結(jié)果顯示，Mr 16 kD的主要過敏原組分在Ⅱ峰，而Mr 62 kD的主要過敏原組分在Ⅲ～Ⅴ峰。見圖5。

圖1 大籽蒿花粉粗提液SDS-PAGE圖Fig.1 SDS-PAGE of Artemisia sieversiana pollen extract

圖2 大籽蒿花粉粗提液免疫印跡圖Fig.2 Western blot of Artemisia sieversiana pollen extract

圖3 大籽蒿花粉粗提液離子交換層析圖Fig.3 Ion exchange chromatography(IEC)of Artemisia sieversiana pollen

3 討論

氣傳致敏花粉是引起呼吸道變態(tài)反應(yīng)性疾病，如過敏性鼻炎、過敏性哮喘等花粉癥主要過敏原。來自菊科的蒿草花粉顆粒是全世界的主要過敏原來源之一［7］，而大籽蒿花粉是蒿屬花粉過敏的重要致敏性花粉之一，也是我國北方最重要的過敏原之一。自從John Bostoek(1989)首次提出花粉癥以來，國內(nèi)外學(xué)者發(fā)現(xiàn)花粉中最主要的致敏成分是蛋白質(zhì)［8］，并通過制備主要致敏花粉過敏原浸液，用于診斷和治療呼吸道的過敏性疾病，并取得了一定的療效［9］。由于天然粗提浸液過敏原的成分非常復(fù)雜，不僅含有引起花粉癥的致敏原蛋白組分，而且還含有多種其他成分，且容易為外源性的毒性物質(zhì)、病原微生物污染，影響其安全性;同時某些致敏蛋白組分具有蛋白酶活性，可降解其他致敏蛋白組分，影響效價［10］。因此分離純化花粉主要過敏原，確定其免疫學(xué)特性對研究呼吸道過敏性疾病的病因和治療是極其重要的。

圖4 大籽蒿花粉粗提液離子交換層析后Ⅰ～Ⅴ峰液的SDSPAGE結(jié)果Fig.4 SDS-PAGE of ion exchange chromatography(IEC)peakⅠ-Ⅴ of Artemisia sieversiana pollen

圖5 大籽蒿花粉粗提液離子交換層析后Ⅰ～Ⅴ峰液的免疫印跡結(jié)果Fig.5 Western blot of ion exchange chromatography(IEC)peakⅠ-Ⅴ of Artemisia sieversiana pollen

本研究通過SDS-PAGE凝膠電泳可以看到大籽蒿花粉分離后可得到20多種蛋白組分，其中Mr為62、57、38、29、25、14 kD 的 6 個條帶蛋白含量最豐富，Mr 62 kD和16 kD的蛋白組分與蒿屬花粉過敏患者血清特異性IgE結(jié)合率最高(均＞50%)，為主要過敏原。該花粉主要過敏原Mr 62 kD的蛋白條帶與楊慧等［8］對艾蒿花粉過敏原進(jìn)行分離鑒定檢出的Mr 62 kD的蛋白條帶相同。另外從SDS-PAGE與Western blot兩實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較分析，我們發(fā)現(xiàn)SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)中蛋白含量高的條帶與蒿屬過敏患者血清特異性IgE結(jié)合率并不一定高，如Mr 29 kD的蛋白條帶未檢測到與蒿屬花粉過敏原特異性IgE結(jié)合，同時也發(fā)現(xiàn)不同種類的蒿屬花粉也具有其特異性的過敏原成分，如大籽蒿花粉主要過敏原Mr為16 kD與Nilsen等［11］檢出的Artemisia vulgaris L花粉主要過敏原Mr為22 kD不同，與楊慧、劉志剛等［12］對青蒿花粉過敏原進(jìn)行分離鑒定出的主要過敏原Mr 43 kD的蛋白條帶亦不同;而且針對不同花粉過敏患者而言，其致敏的過敏原亦不盡相同，本研究結(jié)果表明蒿屬花粉雖然種類繁多，但各種花粉之間可能存在共同過敏原成分。所以對不同的蒿屬花粉過敏原進(jìn)行分離、鑒定與純化具有重要的臨床意義。因此，本實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步研究變態(tài)反應(yīng)性疾病的特異性過敏原制劑及探討呼吸道變態(tài)反應(yīng)性疾病更快速、安全、有效的診斷和治療方法提供理論支持。

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