硝酸鑭對(duì)2型糖尿病大鼠胰腺 INSR、IRS1和細(xì)胞凋亡影響的實(shí)驗(yàn)研究①

李冬梅 黃可欣 馬洪喜(長(zhǎng)春大學(xué)特殊教育學(xué)院，長(zhǎng)春 130022)

2型糖尿病(DM2)是目前全世界增長(zhǎng)最快的疾病之一，多在35～40歲之后發(fā)病，占糖尿病患者90%以上，它是一種多因子疾病，由環(huán)境因素和遺傳因素雙方?jīng)Q定［1］。國(guó)內(nèi)外研究報(bào)道，DM2在外圍組織中胰島素抵抗性存在差異，胰腺β細(xì)胞胰島素分泌的破壞也存在差異，這兩種異常存在交互作用是DM2的發(fā)病機(jī)制之一［2，3］。目前稀土元素的應(yīng)用蓬勃發(fā)展，已擴(kuò)展到科學(xué)技術(shù)的各個(gè)方面，特別是在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，已證實(shí)較低劑量的稀土化合物經(jīng)口服，腹腔注射及尾靜脈注射可降低血糖水平及升高胰島素水平［4，5］。本實(shí)驗(yàn)通過建立 2型糖尿病大鼠模型，檢測(cè)口服硝酸鑭(0.2 mg/kg)對(duì)糖尿病大鼠胰腺胰島素受體(INSR)、胰島素受體底物1(IRS1)和細(xì)胞凋亡的影響，旨在探討硝酸鑭對(duì)糖尿病大鼠胰腺組織的保護(hù)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑 健康雄性Wistar大鼠50只，體質(zhì)量為(160.5±8.5)g由吉林省藥品檢驗(yàn)所提供(動(dòng)物合格證號(hào)960101032);實(shí)驗(yàn)用“硝酸鑭”用生理鹽水稀釋成相應(yīng)濃度，由全國(guó)農(nóng)用稀土研究中心提供;鏈脲佐菌素(STZ)購于美國(guó)Sigma公司;ELISA試劑盒購于南京建成生物有限公司;兔抗鼠一抗 INSR和 IRS1購于 Santa Crus公司;TUNEL凋亡試劑盒購于北京中杉生物有限公司。

1.2 糖尿病模型制備 將40只Wistar雄性大鼠高脂高糖飼料喂養(yǎng)，8周后，腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ，30 mg/kg)以誘導(dǎo)2型糖尿病模型，48 h后采尾血測(cè)空腹血糖，濃度大于16.7 mmol/L為模型復(fù)制成功，該模型成功31只。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及給藥 取未造模的10只動(dòng)物做正常對(duì)照組，造模成功的31只動(dòng)物隨機(jī)分為糖尿病模型組(16只)、硝酸鑭給藥組(15只)，硝酸鑭給藥組每日灌胃硝酸鑭0.2 mg/kg，正常對(duì)照組及糖尿病對(duì)照組均每日給予等劑量生理鹽水，連續(xù)給藥1個(gè)月。在實(shí)驗(yàn)過程中糖尿病模型組動(dòng)物死亡5只、硝酸鑭給藥組動(dòng)物死亡2只。

1.4 標(biāo)本收集 各組動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后次日清晨摘取眼球取血，然后迅速處死取出胰腺固定于10%中性福爾馬林液中，每組隨機(jī)取10個(gè)胰腺組織，常規(guī)石蠟包埋，切成4微米切片4張，分別進(jìn)行HE、免疫組化和TUNEL染色。

1.5 指標(biāo)檢測(cè)

1.5.1 各組大鼠血糖、胰島素的檢測(cè) 血糖采用美國(guó)強(qiáng)生血糖儀測(cè)定;胰島素采用放免法測(cè)定。

1.5.2 各組大鼠血清中INSR、IRS1蛋白含量的測(cè)定 采用酶聯(lián)免疫法，操作嚴(yán)格按照說明書步驟。

1.5.3 各組大鼠胰腺組織中INSR、IRS1蛋白陽性強(qiáng)度的檢測(cè) 采用免疫組化SP法，光鏡下觀察見棕黃色為陽性表達(dá)，結(jié)果分析采用Motic Images Advanced 3.2圖像分析系統(tǒng)測(cè)灰度值，灰度值越低，蛋白含量越高。

1.5.4 各組大鼠胰腺組織中細(xì)胞凋亡率的檢測(cè) 采用TUNEL凋亡試劑盒，操作嚴(yán)格按照說明書步驟。

1.5.5 各組大鼠胰腺組織的病理學(xué)檢測(cè) 采用HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以表示，采用t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)過程中大鼠的一般狀態(tài):對(duì)照組大鼠體重明顯增加、精神活潑、皮毛有光澤、反應(yīng)度靈敏。糖尿病組大鼠明顯消瘦、精神萎靡、皮毛無光澤且反應(yīng)遲鈍。硝酸鑭治療組大鼠體重略增加、精神狀態(tài)較佳、皮毛有光澤、反應(yīng)度較對(duì)照組略差，但明顯好于糖尿病組。

2.1 各組大鼠血中血糖和胰島素水平的比較 與正常對(duì)照組比較，糖尿病模型組大鼠血中血糖水平明顯升高、胰島素水平明顯降低差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);硝酸鑭治療組大鼠血中血糖水平略升高、胰島素水平略降低差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);見表1。

2.2 各組血清中INSR和IRS1的蛋白含量的比較

與正常對(duì)照組比較，糖尿病模型組大鼠血清中INSR和IRS1的蛋白含量明顯降低差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);硝酸鑭治療組大鼠血清中INSR和IRS1的蛋白含量略降低差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);見表1。

2.3 各組大鼠胰腺組織的病理改變 光鏡下可見對(duì)照組大鼠胰腺組織排列緊密、飽滿、胰島體積大，糖尿病模型組大鼠胰腺組織排列較為疏散、胰島體積較小，硝酸鑭組大鼠胰腺組織基本緊密、較為飽滿、胰島體積略小;采用Motic Images Advanced 3.2圖像分析系統(tǒng)半定量分析測(cè)胰島體積(連續(xù)5個(gè)視野):公式=1/2長(zhǎng)徑×短徑2。見表2、圖1。

2.4 各組胰腺組織中INSR和IRS1的蛋白陽性強(qiáng)度的比較 與正常對(duì)照組比較，糖尿病模型組大鼠胰腺組織中INSR和IRS1的蛋白陽性表達(dá)水平明顯降低差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);硝酸鑭治療組大鼠胰腺組織中INSR和IRS1的蛋白陽性表達(dá)水平略降低差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意(P＜0.05);蛋白陽性強(qiáng)度采用Motic Images Advanced 3.2圖像分析系統(tǒng)半定量分析:測(cè)灰度值，灰度值越低，蛋白含量越高。見表2，圖1、2。

2.5 各組胰腺組織中細(xì)胞凋亡率的比較 與正常對(duì)照組比較，糖尿病模型組大鼠胰腺組織中細(xì)胞凋亡率明顯升高差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);硝酸鑭治療組大鼠胰腺組織中細(xì)胞凋亡率略升高差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);細(xì)胞凋亡率采用Motic Images Advanced 3.2圖像分析系統(tǒng)半定量分析:測(cè)灰度值，灰度值越低，凋亡百分率越高。見表2，圖3。

表1 各組血糖、胰島素、INSR和IRS1蛋白含量的比較(，n=10)Tab.1 Comparision of blood suger，insulin，protein contents of INSR and IRS1 in different groups(，n=10)

表1 各組血糖、胰島素、INSR和IRS1蛋白含量的比較(，n=10)Tab.1 Comparision of blood suger，insulin，protein contents of INSR and IRS1 in different groups(，n=10)

Note:Compared with control，1)P ＜ 0.01;Compared with control，2)P ＜ 0.05.

Groups Blood suger(mmol/L) Insulin(mmol/L) INSR(ng/ml) IRS1(ng/ml)0.85 Diabetic model 18.15±2.071) 3.27±0.511) 2.01±0.491) 2.17±0.381)La(NO3)3treatment 6.01±0.942) 6.16±0.682) 3.48±0.522) 3.85±0.722)Control 4.83±0.76 7.22±0.83 4.29±0.36 4.74±

表2 各組大鼠胰腺組織INSR和IRS1蛋白表達(dá)、細(xì)胞凋亡率及胰島體積的比較(，n=10)Tab.2 Comparision of protein expression of INSR and IRS1，apoptosis rate and islet volume in pancreas tissue in different groups(，n=10)

表2 各組大鼠胰腺組織INSR和IRS1蛋白表達(dá)、細(xì)胞凋亡率及胰島體積的比較(，n=10)Tab.2 Comparision of protein expression of INSR and IRS1，apoptosis rate and islet volume in pancreas tissue in different groups(，n=10)

Note:Compared with control，1)P ＜ 0.01;Compared with control，2)P ＜ 0.05.

Groups Islet volume(mm3) INSR(Grey value) IRS1(Grey value) Apoptosis rate(%)17.52±1.47 Diabetic model 2.67±0.491) 154.65±4.571) 162.51±4.691) 72.13±5.261)La(NO3)3treatment 8.92±1.252) 127.49±3.182) 132.16±2.922) 32.13±2.122)Control 10.53±1.01 103.15±3.24 114.27±2.83

圖1 胰腺組織的病理改變(HE染色，×200)Fig.1 Histopathological changes in pancreas tissue(HE staining，×200)

圖2 胰腺組織中INSR的表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色，×200)Fig.2 INSR expression in pancreas tissue(Immunohistochemical staining，×200)

圖3 胰腺組織中IRS1的表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色，×200)Fig.3 IRS1 expression in pancreas tissue(Immunohistochemical staining，×200)

圖4 胰腺組織中細(xì)胞凋亡的表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色，×200)Fig.4 Apoptosis expression in pancreas tissue(Immunohistochemical staining，×200)

3 討論

機(jī)體在高血糖和高游離脂肪酸的刺激下，自由基大量生成，進(jìn)而啟動(dòng)氧化應(yīng)激;氧化應(yīng)激信號(hào)通路的激活會(huì)導(dǎo)致胰島素抵抗、胰島素分泌受損;糖尿病時(shí)胰島素抵抗可以先于糖尿病發(fā)生，當(dāng)胰島素抵抗增強(qiáng)時(shí)血糖開始升高;高血糖加重氧化應(yīng)激，也激活應(yīng)激敏感信號(hào)途徑，從而又加重胰島素抵抗［6，7］。β細(xì)胞也是氧化應(yīng)激的重要靶點(diǎn)，β細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶水平較低，故對(duì)氧化應(yīng)激較為敏感，其直接損傷胰島β細(xì)胞，促進(jìn)β細(xì)胞凋亡，還可通過影響胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路間接抑制β細(xì)胞功能，導(dǎo)致胰島素分泌水平降低、血糖水平上升，對(duì)細(xì)胞造成顯著的損害［8］。

胰島素受體底物(IRS)屬細(xì)胞內(nèi)糖蛋白，胰島素與胰島素受體α亞基結(jié)合后能引起IRS多個(gè)酪氨酸殘基磷酸化;磷酸化的IRS蛋白結(jié)合并激活含有肉瘤同源結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，從而啟動(dòng)級(jí)聯(lián)信號(hào)，進(jìn)而激活下游介導(dǎo)代謝反應(yīng)、細(xì)胞生存、生長(zhǎng)和分化的多重效應(yīng)分子;因此IRS是胰島素受體信號(hào)在胞內(nèi)傳導(dǎo)的重要成分，在胰島素抵抗中起重要作用［9］。胰島素受體底物1是首先被發(fā)現(xiàn)的IRS，無跨膜結(jié)構(gòu)，為一種信號(hào)傳導(dǎo)蛋白，廣泛分布于胰島素敏感組織細(xì)胞漿內(nèi)，在胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中發(fā)揮著重要作用［10］。IRS-1主要存在于骨骼肌，胰腺、脂肪、肝臟等處也有表達(dá)，大量研究認(rèn)為胰島素靶組織細(xì)胞內(nèi)IRS-1蛋白水平的高低及結(jié)構(gòu)和功能狀態(tài)是胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的基礎(chǔ)，當(dāng)表達(dá)降低或IRS-1結(jié)構(gòu)、活性發(fā)生異常時(shí)，胰島素在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)就會(huì)受到阻滯［11］。IRS-1介導(dǎo)胰島素在外周組織代謝、細(xì)胞的增殖分化效應(yīng)中起重要作用;同時(shí)IRS-1還具有一定的調(diào)節(jié)胰島β細(xì)胞分泌胰島素的作用［12］。引起胰島細(xì)胞功能障礙的原因比較復(fù)雜，細(xì)胞凋亡是DM2胰島β細(xì)胞數(shù)量減少的主要原因，凋亡引起的胰島β細(xì)胞數(shù)量減少足以致高血糖。大量的研究顯示胰島β細(xì)胞的高水平凋亡在糖尿病發(fā)生前就已存在，糖尿病發(fā)生后，凋亡水平進(jìn)一步增高，胰島β細(xì)胞的凋亡可能是導(dǎo)致DM2發(fā)生、發(fā)展的一個(gè)重要因素［13］。DM2時(shí)有多種因素可誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞凋亡，同時(shí)胰島素受體(INSR)和IRS1是胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的重要介質(zhì)，因此導(dǎo)致胰島功能受損，胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)障礙在胰島素抵抗和2型糖尿病的形成過程中起到了非常關(guān)鍵的作用［14］。

糖尿病發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，至今仍未完全闡明。隨著稀土微肥的廣泛應(yīng)用，稀土元素通過食物鏈進(jìn)入機(jī)體內(nèi)［15］。依據(jù)INSR、IRS1和細(xì)胞凋亡在糖尿病發(fā)病中的相互機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)通過建立DM2大鼠模型，觀察硝酸鑭對(duì)糖尿病大鼠INSR、IRS1和細(xì)胞凋亡的影響，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn):形態(tài)學(xué)觀察可見對(duì)照組大鼠胰腺組織排列緊密、飽滿、胰島體積大;糖尿病模型組大鼠胰腺組織排列較為疏散、胰島體積較小;硝酸鑭組大鼠胰腺組織基本緊密、飽滿、胰島體積略小。免疫學(xué)觀察與正常對(duì)照組比較，糖尿病模型組大鼠血中血糖及胰腺組織中細(xì)胞凋亡率明顯升高、血中胰島素、INSR和IRS1的蛋白含量及胰腺組織中INSR和IRS1的蛋白陽性表達(dá)水平明顯降低差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);硝酸鑭治療組大鼠血中血糖及胰腺組織中細(xì)胞凋亡率略升高、血中胰島素、INSR和IRS1的蛋白含量及胰腺組織中INSR和IRS1的蛋白陽性表達(dá)水平略降低差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。提示:硝酸鑭可通過下調(diào)糖尿病大鼠血糖水平、抑制胰腺組織的細(xì)胞凋亡，上調(diào)胰腺組織INSR和IRS1的水平及胰島素水平，對(duì)糖尿病大鼠胰腺組織有一定的保護(hù)作用。

［1］孫曉芳，趙長(zhǎng)勇，陳 暉，等.高糖高脂飲食加鏈尿佐菌素建立實(shí)驗(yàn)性大鼠2型糖尿病模型［J］.南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2009，29(6):797-800.

［2］Olckers A，Layh K，Towers GW，et al.Protective effect against type 2 diabetesm ellitus identified with in the ACDC gene in a black south African diabetic cohort［J］.Metabolism，2007，56(5):587-592.

［3］謝利芳，許志華，郭凱霞.2型糖尿病胰島素抵抗研究進(jìn)展［J］.科學(xué)技術(shù)與工程，2010，10(15):3664-3667.

［4］陳 曦，聶毓秀，周 莉，等.低劑量氯化鐠對(duì)體外培養(yǎng)大鼠胰島β細(xì)胞分泌胰島素的影響［J］.中國(guó)稀土學(xué)報(bào)，2001，19(3):254-256.

［5］黃可欣，馬洪喜，石 博，等.低劑量混合稀土常樂對(duì)大鼠血清胰島素及肝細(xì)胞糖原的影響［J］.環(huán)境與健康雜志，2007，24(6):403-405.

［6］Abel ED，Peroni O，KM JK，et al.Adipose-selective targeting of the GLUT4 gene impairs insulin action in muscle and liver［J］.Nature，2001，409(6821):729-733.

［7］IaIatrakis G，Tsionis C，Adonakis G，et al.Polycystic ovarian syndrome，insulin resistance and thickness of the endometrium［J］.Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol，2006，127(2):218-221.

［8］劉紅櫻，胡齊鳴.黃連素對(duì)2型糖尿病(濕熱內(nèi)蘊(yùn)型)胰島β細(xì)胞功能的影響［J］.中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志，2008，15(3):12-14.

［9］蔡 輝，袁愛紅，魏群利，等.針刺對(duì)2型糖尿病大鼠脂肪組織INSR基因表達(dá)的影響［J］.安徽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，29(2):36-39.

［10］袁愛紅，劉志誠(chéng)，魏群利，等.針刺對(duì)2型糖尿病大鼠肝組織IRS-1基因表達(dá)的調(diào)節(jié)［J］.中國(guó)老年學(xué)雜志，2009，29(7):821-823.

［11］Wiedmann M，Tamaki S，Silberman R，et al.Constitlutive over-ex-pression of the insulin receptor subst ratel causes functional upregulation of Fas receptor［J］.J Hepatol，2003，38(6):803-810.

［12］舒 適，劉小美，宋麗娜，等.小聚堿對(duì)2型糖尿病大鼠IRS-1/-2、p85 基因表達(dá)的影響［J］.浙江中醫(yī)雜志，2009，44(4):254-257.

［13］Gual P，Le Marchand-B rustel Y，Tanti JF，et al.Positive and negative regulation of insulin signaling through IRS-1 phosphory lation［J］.Biochimie，2005，87(1):99-109.

［14］Fasshauer M，Klein J，Kriauciunas KM，et al.Essential role of insulin receptor substrate 1 in differentiation of brown adipocytes［J］.Mol Cell Biol，2001，21(1):319-329.

［15］汪 偉，李冬梅，李 銳，等.口服低劑量混合稀土"常樂"對(duì)糖尿病大鼠心肌NF-KB和TNF-α表達(dá)的影響［J］.毒理學(xué)雜志，2013，27(4):284-287.