門冬氨酸鳥氨酸注射液工藝質(zhì)量研究

顧大業(yè)，王成永，汪洪湖，陳文婕，戴榮歡

（1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，合肥230001；2.安徽蚌埠豐原醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司，安徽 蚌埠233000）

門冬氨酸鳥氨酸注射液于20世紀(jì)70年代最先在德國應(yīng)用于臨床，于1991年收載入德國藥典，同時并被美國FDA 批準(zhǔn)用于治療肝性腦病。門冬氨酸鳥氨酸是由門冬氨酸與鳥氨酸聚合形成穩(wěn)定的二肽聚合物，鳥氨酸是通過肝臟鳥氨酸循環(huán)來加速尿素的合成，促進(jìn)氨的代謝，因而達(dá)到降低血氨濃度。天門冬氨酸則是間接參與三羧酸循環(huán)以及核酸的合成，從而有利于對受損肝細(xì)胞進(jìn)行修復(fù)，也促進(jìn)了肝細(xì)胞內(nèi)的能量生成［1］。門冬氨酸鳥氨酸注射液在我國也是首個用于臨床具有解毒、護肝、能量三效合一的新藥，其主要有效成分是門冬氨酸鳥氨酸，化學(xué)名稱為（S）－2，5－二氨基戊酸（s）－2－氨基丁二酸鹽，分子式：C9H19N3O6，相對分子質(zhì)量：265.27［2］。臨床主要應(yīng)用于急、慢性肝病的治療，其包括肝硬化、脂肪肝以及肝炎所引起的血氨升高癥狀，其中對肝性腦病尤其有效［3］。

一 材料與方法

為篩選優(yōu)化工藝參數(shù)，實驗以溶液PH 值、配液溫度以及充氮壓力為考察因素，以樣品中門冬氨酸鳥氨酸和鳥氨酸內(nèi)酰胺鹽的含量為考察指標(biāo)，，選用L9（34）正交表進(jìn)行試驗，優(yōu)選出該注射液的最佳配制工藝參數(shù)，按照篩選出的最佳工藝參數(shù)配制出的樣品經(jīng)留樣觀察和儀器分析檢測表明各項指標(biāo)均符合門冬氨酸鳥氨酸注射液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求，從而確保了該產(chǎn)品的質(zhì)量可靠與穩(wěn)定。

試藥及物料。門冬氨酸鳥氨酸原料藥（批號：120824，含量：99.62%，水分3.2%，自制）；門冬氨酸鳥氨酸對照品（中國藥品生物制品檢定所），鳥氨酸內(nèi)酰胺鹽對照品（120827，自制），氨水（江蘇彤晟化學(xué)試劑有限公司，分析純）；磷酸（江蘇強盛化工有限公司，分析純）；乙腈（分析純），微孔濾膜（0.22um，PALL公司）；玻璃安瓿（10mL棕色，兆豐（丹陽）新型藥用包材有限公司）。

儀器及設(shè)備。磁力攪拌器（江蘇金壇市金城國勝實驗儀器廠），KQ3200B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；安瓿拉絲灌封機（上海遠(yuǎn)東制藥機械總廠）；TU－1901雙光束紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；高效液相色譜儀（waters）。

二 配置方法

（一）考察指標(biāo)的確定與檢測方法

通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)和一些預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)，門冬氨酸鳥氨酸在偏堿的溶液體系中鳥氨酸會降解，引起鳥氨酸內(nèi)酰胺鹽增加。又根據(jù)預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)，門冬氨酸鳥氨酸隨著溫度升高顏色加深，含量降低且鳥氨酸內(nèi)酰胺鹽增加。所以選擇門冬氨酸鳥氨酸含量和鳥氨酸內(nèi)酰胺鹽為主要考察指標(biāo)，參照國家藥品監(jiān)督管理局標(biāo)準(zhǔn)YBH04442011門冬氨酸鳥氨酸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，采用HPLC法測定注射液樣品中門冬氨酸鳥氨酸含量和鳥氨酸內(nèi)酰胺鹽。

（二）相關(guān)因素與水平的確定

通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)和一些預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)，配制溶液溫度越高，門冬氨酸鳥氨酸溶解越完全，但溫度過高，不利于主藥的穩(wěn)定。充氮量越少，溶液中的殘留空氣越多，越不利于主藥穩(wěn)定，但通氮量過大，會引起溶液溫度迅速下降，也不利于主藥完全溶解，故影響其含量。PH 值越大，鳥氨酸越不穩(wěn)定，雜質(zhì)含量也越偏高。因此，結(jié)合原有工藝參數(shù)，選取注射液配制時的PH 值、溫度以及充氮壓力為考察因素，每個因素選三個水平進(jìn)行L9（34）正交表平行試驗，采用綜合評分法對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析（其權(quán)重系數(shù)分別為0.6，0.4），優(yōu)選最佳配液工藝，因素水平見表1。

表1 因素水平

（三）正交試驗設(shè)計

按照正交設(shè)計的試驗條件來進(jìn)行樣品的配制，稱取門冬氨酸鳥氨酸約100g若干份，分別置250ml燒杯中加入100ml注射用水放入相應(yīng)溫度的水浴鍋中勻速攪拌30min至全溶，然后定容至200ml，樣品配制好后進(jìn)行過濾、灌封、滅菌，然后留樣觀察，并按國家食品藥品監(jiān)督管理局門冬氨酸鳥氨酸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)檢驗門冬氨酸鳥氨酸與鳥氨酸內(nèi)酰胺鹽的含量。正交試驗設(shè)計見表1，試驗結(jié)果見表2，方差分析見表3。

（四）門冬氨酸鳥氨酸及鳥氨酸內(nèi)酰胺鹽含量的測定［4，5］

色譜條件。Waters 1525－2487－TCM－717Alltima Amino色譜柱（4.6mm×250mm，5 um）；流動相：乙腈－0.05mol／L 磷酸二氫鉀溶液（50∶50）；檢測波長：210nm；流速：1.0mL／min；柱溫：30 ℃。

對照品溶液的制備。取門冬氨酸鳥氨酸對照品適量，精密稱定，加流動相溶解并稀釋制成每毫升含1mg的溶液，即得對照品溶液。

表2 正交試驗結(jié)果

表3 方差分析表

供試品溶液的制備。精密量取門冬氨酸鳥氨酸注射液0.2ml，置100ml量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

含量測定。精密量取供試品和對照品20ul注入HPLC儀，記錄色譜圖，按外標(biāo)法計算門冬氨酸鳥氨酸含量，面積歸一化法計算鳥氨酸內(nèi)酰胺鹽含量。

（1）式中：As為供試品中門冬氨酸鳥氨酸的峰面積；Cr為門冬氨酸鳥氨酸對照品的濃度，mg／ml；Ar為對照品中門冬氨酸鳥氨酸的峰面積；Cs為供試品中門冬氨酸鳥氨酸的標(biāo)示濃度，mg／ml。

三 結(jié)果分析

通過對表2直觀分析表明，以綜合評分為標(biāo)準(zhǔn)，在所選的因素水平范圍內(nèi)，各因素作用順序為B＞A＞C，最佳提取組合為：A1B3C2，即：溶解溫度為40°，PH 值為6.0，充氮壓力為0.6 MPa。通過對表3的方差分析表明，只有因素C（充氮壓力）有顯著性影響（P＜0.05），而因素A（溶解溫度）、因素B（PH 值）對試驗結(jié)果均無顯著影響（P＞0.05），考慮到生產(chǎn)上的節(jié)能和經(jīng)濟性問題，優(yōu)選因素水平組合為A1B2C2，即溶解溫度為40°，PH值為6.0，充氮壓力為0.6MPa。

四 最佳工藝驗證

分別稱取5份門冬氨酸鳥氨酸原料藥約100g置250ml燒杯中加100ml純化水至40°水浴鍋上加熱攪拌30min后冷卻，然后定容至200ml，用1mol／L NaoH－HCL 調(diào)PH 到6.0，再過濾充氮灌封，實驗結(jié)果表明門鳥平均含量為100.93%；鳥氨酸內(nèi)酰胺鹽的平均含量為0.397%。實驗結(jié)果見表4。

表4 工藝驗證試驗

通過表4工藝驗證試驗結(jié)果表明5個平行樣門冬氨酸鳥氨酸含量的RSD 為0.371%小于限度2%，鳥氨酸內(nèi)酰胺鹽含量的RSD 為0.808%小于限度20%，因此表明該方案A1B2C2的重現(xiàn)性較好，說明此小試工藝的條件穩(wěn)定可行。

五 討論

門冬氨酸鳥氨酸是由鳥氨酸和天門冬氨酸通過成鹽反應(yīng)生成的二肽聚合物，其性質(zhì)不穩(wěn)定，注射液在高溫、光照、偏堿環(huán)境中鳥氨酸易成環(huán)，顏色加深，導(dǎo)致含量降低，雜質(zhì)偏大。因此優(yōu)選適宜的配制工藝參數(shù)對其質(zhì)量影響作用重大，本文是通過正交試驗法優(yōu)選出了門冬氨酸鳥氨酸注射液配制工藝參數(shù)，按篩選出的工藝條件來制備樣品并檢測樣品中門冬氨酸鳥氨酸含量和鳥氨酸內(nèi)酰胺鹽量，結(jié)果顯示根據(jù)篩選的工藝參數(shù)配制的注射液性質(zhì)穩(wěn)定，質(zhì)量可靠。

本研究是從優(yōu)化工藝參數(shù)的角度來進(jìn)行篩選，可用于指導(dǎo)實際生產(chǎn)。但改善門冬氨酸鳥氨酸注射液的質(zhì)量還可以從篩選處方著手。因為門冬氨酸鳥氨酸注射液長期貯存有不穩(wěn)定現(xiàn)象，所以可以考慮通過加入合適的PH 調(diào)節(jié)劑和抗氧劑來提高溶液的穩(wěn)定性。故可以通過對門冬氨酸鳥氨酸注射液的處方和生產(chǎn)工藝來進(jìn)行優(yōu)化，解決產(chǎn)品在貯存過程中的不穩(wěn)定現(xiàn)象，甚至可以耐受終端滅菌等現(xiàn)實問題，將有利于提高門冬氨酸鳥氨酸注射液的品質(zhì)。

［1］陳孝治.瑞甘［J］.中南藥學(xué)，2004，2（4）：254－255.

［2］蔣音，陳良，巫善明.門冬氨酸鳥氨酸的藥理作用與臨床應(yīng)用［J］.世界感染雜志，2007，7（5）：415－418.

［3］何昌武，張彥秋.門冬氨酸－鳥氨酸治療病毒性肝炎膽紅素升高的療效觀察［J］.中國自然醫(yī)學(xué)雜志，2009，11（1）：74－75.

［4］王榮梅.高效液相色譜法測定鹽酸精氨酸注射液的含量［J］.中國生化藥物雜志，2003，24（6）：296－297.

［5］繆寧梅，馬婕.高效液相色譜法測定門冬氨酸鳥氨酸注射液的含量［J］.中國生化藥物雜志，2007，28（1）：52－53.