HPLC-ELSD測定人參歸脾丸中黃芪甲苷的含量

李曉達(dá)，郭偉英

(遼寧醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，遼寧 錦州 121001)

人參歸脾丸是由人參80 g、白術(shù)(麩炒)160 g、茯苓160 g、甘草(蜜炙)40 g、黃芪(蜜炙)80 g、當(dāng)歸160 g、木香40 g、遠(yuǎn)志(去甘草炙)160 g、龍眼肉160 g、酸棗仁(炒)80 g 10 味中藥組成［1］，用于益氣補(bǔ)血，健脾養(yǎng)心 用于心脾兩虛，氣血不足所致的心悸，怔忡，失眠健忘，食少體倦，面色萎黃以及脾不統(tǒng)血所致的便血崩漏帶下諸癥。炙黃芪協(xié)助人參有益氣補(bǔ)脾的功效。黃芪甲苷是黃芪中的重要成分，通過測定黃芪甲苷的含量來達(dá)到對(duì)人參歸脾丸的質(zhì)量控制。因此本文測定了人參歸脾丸中黃芪甲苷的含量。為人參歸脾丸的質(zhì)量控制提供更全面有效的方法。

1 儀器與材料

高效液相色譜儀(日本日立公司)，L-2130四元梯度泵，D-2000 Elite 色譜工作站，蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD)(美國奧泰公司)。乙腈、甲醇和甲酸均為色譜純，重蒸水為自制。黃芪甲苷對(duì)照品 (上海源葉生物科技有限公司，批號(hào):20120501，純度＞98.0%)。3 批市售人參歸脾丸(購自錦州藥店，規(guī)格9 g 丸批號(hào):0010267，2013188，3010441);10 味單味藥材(購自錦州藥店)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)色譜柱 色譜柱Agilent TC C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)柱溫25 ℃，流動(dòng)相:甲醇-水 (75∶25)，流速1.0 mL·min-1;ELSD 參數(shù):漂移管溫度90 ℃，載氣流量1.6 L·min-1，載氣為空氣;分離度均＞1.5;理論板數(shù)按黃芪甲苷計(jì)算不低于3 000;進(jìn)樣量10 μL。在上述色譜條件下各成分色譜峰峰型對(duì)稱，黃芪甲苷與其他峰能夠基線分離。

2.2 溶液的配制

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取干燥至恒重的黃芪甲苷對(duì)照品0.32 mg，置于1 mL 容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液，備用。

2.2.2 樣品溶液的制備 取本品18 g，加入甲醇100 mL 超聲提取2 次，每次30 min，合并提取液，減壓濃縮至干，加水10 mL 超聲溶解，用水飽和的正丁醇萃取3 次，合并正丁醇層，減壓濃縮至干，加10 mL 甲醇溶解，過0.45 μm 濾膜，備用。

2.2.3 陰性樣品制備 按處方比例及工藝，制備不含黃芪的陰性樣品，再按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備成陰性樣品溶液，備用。

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 分別精密稱取黃芪甲苷對(duì)照品適量，加甲醇配制成濃度分別為600、450、300、150、75、37.5 μg·mL-1的系列溶液，按上述色譜條件分別進(jìn)樣測定。以溶液濃度的自然對(duì)數(shù)(X)為橫坐標(biāo)，峰面積積分值的自然對(duì)數(shù)(Y)為縱坐標(biāo)，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為Y=0.942 1X +6.263 4 (r=0.999 8)。結(jié)果表明黃芪甲苷的含量在37.5～600 μg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好線性關(guān)系。

2.3.2 精密度考察 精密吸取同一對(duì)照品溶液，按上述色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6 次，每次10 μL，測定黃芪甲苷峰面積積分值。結(jié)果顯示保留時(shí)間穩(wěn)定，峰面積的RSD=0.76% (n=6)，表明儀器精密度良好。

2.3.3 重復(fù)性考察 取同一批號(hào)人參歸脾丸6 份，在上述色譜條件下測定，計(jì)算黃芪甲苷含量的RSD 為0.61%，結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.4 穩(wěn)定性考察 精密吸取同一對(duì)照品溶液，室溫下放置，于0，2，4，6，8，12 h 按上述色譜條件進(jìn)樣分析。測得黃芪甲苷峰面積的RSD 為1.1%。結(jié)果表明黃芪甲苷在12 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.5 加樣回收率 精密稱取已知含量的人參歸脾丸1 g，分別定量加入黃芪甲苷對(duì)照品，按上述色譜條件測定，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果:見表1，平均回收率為98.8%，RSD=3.4%。

2.4 樣品含量測定 取不同批號(hào)的樣品，按上述色譜條件測定。結(jié)果見表2。樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的高效液相色譜圖見圖1。

表1 人參歸脾丸回收率實(shí)驗(yàn)

表2 人參歸脾丸中黃芪甲苷測定結(jié)果

3 討 論

人參歸脾丸是較為常用的中成藥，在部頒標(biāo)準(zhǔn)中只有顯微鑒別和當(dāng)歸的薄層鑒別?？娊鹭?cái)［2］利用薄層色譜法對(duì)人參歸脾丸中的人參和白術(shù)進(jìn)行了定性鑒別。林德平［3］等對(duì)人參歸脾丸中的黃芪、甘草、酸棗仁、木香分別薄層定性分析。尚春英［4］等通過薄層色譜法對(duì)人參歸脾丸中的白術(shù)、甘草進(jìn)行了鑒別。在對(duì)人參歸脾丸的研究中缺乏對(duì)指標(biāo)成分的定量分析，這對(duì)藥品的質(zhì)量控制帶來了很大的不便。

對(duì)于檢測器的選擇，黃芪甲苷為黃芪中的主要成分，但黃芪甲苷在紫外檢測器上只有末端有吸收，噪音大，靈敏度降低，因此對(duì)于黃芪甲苷的含量測定多采用蒸發(fā)光散射檢測器［5-7］。蒸發(fā)光散射檢測器為通用型質(zhì)量檢測器，檢測時(shí)流動(dòng)相在檢測器內(nèi)揮發(fā)成氣體，樣品組分形成氣溶膠，進(jìn)入檢測室產(chǎn)生響應(yīng)，響應(yīng)大小由被分析物質(zhì)的顆粒的數(shù)量和大小決定，從而獲得理想的基線和檢測的靈敏度，克服了紫外末端檢測的不足［8］。

由于所研究的中成藥中有10 味中藥，成分復(fù)雜，在流動(dòng)相選擇和提取工藝方面都進(jìn)行了詳細(xì)的考察。對(duì)于流動(dòng)相的選擇，選取乙腈、水和甲醇水比例分別為(10∶90、20∶80、32∶68、50∶50、75∶25)結(jié)果以75∶25 分離效果好，黃芪甲苷能與其他成分達(dá)到基線分離，由于乙腈價(jià)格較貴和毒性較大，確定甲醇水為流動(dòng)相。對(duì)于提取方法的選擇，我們考察了甲醇提取直接檢測和用正丁醇萃取后再檢測，前者無法檢測到黃芪甲苷，后者黃芪甲苷與其他成分分離效果較好。

本實(shí)驗(yàn)研究的方法能夠快速，方便，準(zhǔn)確的檢測人參歸脾丸中黃芪甲苷的含量，為人參歸脾丸的質(zhì)量控制提供參考。

圖1 人參歸脾丸樣品高效液相色譜圖

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