輪葉蒲桃組織培養(yǎng)試驗(yàn)

呂秀立，練發(fā)良，張慶費(fèi)，商侃侃，戴海英，王軍峰，趙彩芳

（1.上海市園林科學(xué)研究所，上海 200232；2.浙江省麗水市林業(yè)科學(xué)研究院，浙江 麗水 323000；3.浙江省林業(yè)科學(xué)研究院，浙江 杭州 310023）

輪葉蒲桃（Syzygium grijsii）系桃金娘科蒲桃屬常綠灌木，樹體矮小，冠形規(guī)則緊湊，葉片細(xì)小有光澤，花朵粉白色，雄蕊眾多，花絲纖細(xì)優(yōu)美。嫩葉彩葉期較短，約6 ～ 8 d，但由于輪葉蒲桃有多次抽梢的習(xí)性，自早春起至有凍害發(fā)生前，新梢?guī)缀醪婚g斷的抽發(fā)，為此其嫩葉彩色效果也可持續(xù)很長(zhǎng)的時(shí)間，具有很好的觀賞效果，是傳統(tǒng)常用的盆景制作材料。輪葉蒲桃病蟲害少，適應(yīng)性強(qiáng)，自然分布于長(zhǎng)江中下游以南的湖北、湖南、江西、浙江、安徽、福建、廣東、廣西、貴州等地的干燥貧瘠山地中，習(xí)性喜陽(yáng)亦耐陰，耐干旱瘠薄，是難得的集優(yōu)良觀賞性和環(huán)境適應(yīng)性于一體的優(yōu)良木本地被植物資源。

輪葉蒲桃目前絕大多數(shù)種苗為籽播苗，因此個(gè)體間性狀分離嚴(yán)重，形態(tài)差異顯著，例如嫩葉葉色有深紅色、橙紅色、淡紅色、嫩綠色等；葉形有長(zhǎng)橢圓形、橢圓形、卵形、菱形；葉片的大小有米葉、細(xì)葉、小葉；不同個(gè)體間抗寒能力也不同，這為實(shí)生選種建立優(yōu)良無(wú)性系提供了良好契機(jī)。

輪葉蒲桃枝條纖細(xì)，積累營(yíng)養(yǎng)成分少，我們?cè)诓煌竟?jié)，多次進(jìn)行扦插試驗(yàn)，成活率均不高，且受季節(jié)限制，結(jié)果不穩(wěn)定，多代扦插引起了種苗性狀退化，因此嘗試采用組織培養(yǎng)的方式進(jìn)行無(wú)性繁育，為優(yōu)良單株的繁育進(jìn)而形成品系奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

春季取帶節(jié)莖段為試驗(yàn)材料，節(jié)中包含腋芽。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基配方設(shè)計(jì) 初代培養(yǎng)基選擇為WPM＋BA 0.2 mg/L＋I(xiàn)BA 0.2 mg/L。

增殖階段，分別采用MS、1/2MS、WPM為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，NAA0.1 mg/L，BA設(shè)置為0.2、0.4、0.8 mg/L 3種濃度梯度。

生根階段，采用1/2WPM、WPM為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，NAA、IBA分別設(shè)置為0.05、0.10、0.20、0.50、1.0 mg/L 5種濃度梯度。

1.2.2 培養(yǎng)條件 無(wú)菌苗于光照條件下培養(yǎng)，光照度1 500 lx，光周期12 h/d，溫度25℃。各種培養(yǎng)基的pH調(diào)為5.75，蔗糖3%，瓊脂0.64%，分裝后在高壓滅菌鍋中121℃條件下保持18 min。

1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)時(shí)，每種處理調(diào)查20個(gè)，統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)率、芽增殖系數(shù)及生根率。

1.2.4 試管苗的移栽 將生根試管苗洗凈培養(yǎng)基后，移栽于草炭與珍珠巖的混合介質(zhì)中，移栽初期注意保濕。

2 結(jié)果與分析

2.1 無(wú)菌材料的獲得

帶節(jié)莖段去枝葉后剪成2 cm長(zhǎng)的外植體，用自來(lái)水洗凈，然后于超凈工作臺(tái)上，用75%的乙醇浸泡30 s，10%的“84消毒液”浸泡12 min，無(wú)菌水沖洗5 ～ 6次后，接種于初代培養(yǎng)基中，無(wú)菌苗獲得率為25%。

2.2 芽的分化和增殖

在所設(shè)計(jì)的培養(yǎng)基中，接種后第15 d可觀察到，接種在MS培養(yǎng)基上的試管苗生長(zhǎng)不良，發(fā)紅萎蔫，培養(yǎng)30 d后，逐漸衰弱，直至死亡；1/2MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基的幾種處理中，組培苗生長(zhǎng)黃弱，纖細(xì)；而在WPM基礎(chǔ)培養(yǎng)基處理中，輪葉蒲桃組培苗葉片綠色，生長(zhǎng)良好，增殖迅速。由此可見大量元素的種類及含量會(huì)影響輪葉蒲桃組培苗的生長(zhǎng)狀態(tài)。

增殖一般以2 ～ 3個(gè)小芽為一單位，粗壯的大芽可切成帶兩個(gè)節(jié)位的莖段，插植于增殖培養(yǎng)基上誘導(dǎo)不定芽的分化，切割時(shí)注意切除枯死老葉和基部愈傷組織以及剔除不正常芽。隨著細(xì)胞分裂素濃度的提高，誘導(dǎo)率及增殖系數(shù)都隨之升高，但當(dāng)BA濃度達(dá)到 0.8 mg/L時(shí)，二者均出現(xiàn)下降趨勢(shì)（表1）。

綜合考慮，以培養(yǎng)基WPM＋BA 0.4 mg/L＋NAA 0.1 mg/L做為輪葉蒲桃比較適宜的增殖培養(yǎng)基，每世代增殖系數(shù)為2.38左右。

表1 不同激素及不同激素水平對(duì)輪葉蒲桃芽增殖的影響Table1 Effect of different hormones and concentrations on bud induction of S.grijsii

2.3 生根培養(yǎng)

生根培養(yǎng)時(shí)，發(fā)現(xiàn)添加生長(zhǎng)素 NAA的培養(yǎng)基容易引起組培苗基部愈傷化，生根率也比較低，而添加IBA的培養(yǎng)基容易誘導(dǎo)生根，且沒(méi)有愈傷組織生成，培養(yǎng)15 d左右幼苗基部分化出許多白色的根原基，30 d后可以長(zhǎng)至4 ～ 6 cm，須根眾多，枝葉均能正常生長(zhǎng)，形成完整的試管苗。切割不定芽進(jìn)行誘根培養(yǎng)時(shí)，基部要注意切除干凈，切口平整，保留芽的高度2 cm。在培養(yǎng)基1/2WPM＋I(xiàn)BA 0.2 mg/L中輪葉蒲桃生根率達(dá)到75%，可以做為合適的生根培養(yǎng)基（表2）。

表2 不同激素及不同激素水平對(duì)輪葉蒲桃生根的影響Table2 Effect of different hormones and concentrations on rooting of S.grijsii

2.4 試管苗移栽

待輪葉蒲桃根系長(zhǎng)至1.5 cm左右長(zhǎng)度時(shí)，選擇根系發(fā)達(dá)生長(zhǎng)健壯的無(wú)菌苗從瓶中取出，用自來(lái)水洗凈根部的培養(yǎng)基，清洗時(shí)注意保護(hù)根不被折斷，并且要徹底洗凈根上的瓊脂，以免腐爛而影響成活率。用500倍托布津水溶液浸泡根部30 s，然后移栽到草炭：珍珠巖 = 1：1的基質(zhì)中。移栽初期一周內(nèi)，需要保持相對(duì)濕度95%左右，待新的根系發(fā)育完整后，再逐漸降低濕度，加強(qiáng)光強(qiáng)至全光照。在溫室中馴化45 d后，即可移栽室外，給予肥水管理，輪葉蒲桃在9、10月試管苗移栽其成活率可達(dá)80%以上。

3 討論

迄今，關(guān)于蒲桃物種的研究?jī)H限于引種[1～3]、栽培[4]、適應(yīng)性研究[5]、開花物候特性研究[6]、光合生理研究[7]、葉表皮特征比較[8]等方面。劉小芬等曾對(duì)輪葉蒲桃葉片揮發(fā)油化學(xué)成分進(jìn)行了細(xì)致的分析[9]，我們也對(duì)輪葉蒲桃進(jìn)行了夏季移栽成活率試驗(yàn)[10]，發(fā)現(xiàn)采用帶土球種植的方式，苗木存儲(chǔ)時(shí)間在33 h之內(nèi)，輪葉蒲桃夏季移栽成活率可達(dá)97%以上，綠化效果良好。但該屬植物單株選優(yōu)以及離體快繁未見任何報(bào)道，本試驗(yàn)首先在國(guó)內(nèi)建立了輪葉蒲桃的組織培養(yǎng)技術(shù)體系，為繁育優(yōu)株建立無(wú)性系奠定了基礎(chǔ)。

離體植物的生長(zhǎng)和形態(tài)建成可以通過(guò)控制礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)的最佳濃度組成來(lái)有效調(diào)節(jié)，植物種和變種對(duì)不同礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)元素的特異性不同，為優(yōu)化培養(yǎng)條件，有必要為每一個(gè)種甚至基因型確定最佳的營(yíng)養(yǎng)組成，礦質(zhì)元素對(duì)組培苗生理狀態(tài)的影響，已有諸多報(bào)道[11～14]。在輪葉蒲桃的離體培養(yǎng)中也發(fā)現(xiàn)，低鹽濃度的WPM基本培養(yǎng)基比較適合其生長(zhǎng)，而高鹽濃度的MS基本培養(yǎng)基，容易引起它的死亡，說(shuō)明MS基本培養(yǎng)基里的K、Ca、Mg等離子濃度含量超過(guò)了輪葉蒲桃的需要量極限，形成脅迫，不適宜做輪葉蒲桃培養(yǎng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

植物離體培養(yǎng)研究中，試管苗移栽成活是關(guān)鍵所在，標(biāo)志著試驗(yàn)的成熟完善，輪葉蒲桃為木本植物，移栽有一定的難度。從本研究的結(jié)果看，只要解決好試管苗的根系質(zhì)量問(wèn)題，初期保濕，溫室煉苗45 d后，再進(jìn)行室外移栽定植，在9－10月移栽其成活率可達(dá)80%以上。

本研究的最終目的是穩(wěn)定輪葉蒲桃優(yōu)良性狀，并且能夠應(yīng)用于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，從本研究的結(jié)果看，在生產(chǎn)過(guò)程中，添加低濃度細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素，并采用直接器官發(fā)生形式，以芽繁芽進(jìn)行組培快繁生產(chǎn)出來(lái)的試管苗經(jīng)大田種植，能穩(wěn)定母株的優(yōu)良性狀，無(wú)變異發(fā)生，很好地解決了通過(guò)種子或扦插繁殖種苗引起的株性分離而制約生產(chǎn)的問(wèn)題。

[1]王振師，謝繼紅.方枝蒲桃的引種繁殖栽培和園林應(yīng)用[J].廣東園林，2002 （4）：32－34.

[2]楊輝明，鐘金宏，許建新，等.年青蒲桃引種試驗(yàn)初報(bào)[J].廣東林業(yè)科技，2007，23（6）：36－39.

[3]潘云平，李平，張西森，等.蒲桃南果北植引種技術(shù)[J].內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)科技，2011（4）：98－99.

[4]周菊珍，杜鈴.林榕庚海南蒲桃的栽培技術(shù)[J].廣西林業(yè)科學(xué)2001，30（2）：99－100.

[5]雷江麗，戴耀良，譚一凡.紅葉石楠和鐘花蒲桃在深圳的適應(yīng)性研究[J].廣東園林，2009（4）：57－59.

[6]顧克瀟，賴家業(yè)，汪洋.紅鱗蒲桃開花物候特性研究[J].廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，40（5）：552－555.

[7]招禮軍，李淼，謝偉東，等.2種培養(yǎng)基質(zhì)紅鱗蒲桃苗木的光合生理日變化初探[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2010，26（2）：141－144.

[8]黃曉冬，劉劍秋.福建蒲桃屬7種植物葉表皮特征的比較[J].生命科學(xué)研究，2003，7（4）：229－335.

[9]劉小芬，劉劍秋.輪葉蒲桃葉片揮發(fā)油化學(xué)成分分析[J].林業(yè)科學(xué)，2006，42（3）：81－84.

[10]練發(fā)良，雷珍，柳新紅.輪葉蒲桃夏季移栽成活率試驗(yàn)[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010（3）：223－224.

[11]富艷臣，鄧正正，王力華，等.檸條錦雞兒組培苗繼代培養(yǎng)中礦質(zhì)元素的吸收規(guī)律[J].遼寧林業(yè)科技，2007（3）：13－15, 25.

[12]陳金慧，施季森.鵝掌楸組培苗的生根及移栽技術(shù)[J].林業(yè)科技開發(fā)，2002，16（5）：21－22.

[13]張偉，朱方平.礦質(zhì)元素對(duì)鳳梨組培褐變的影響[J].農(nóng)業(yè)科技通訊，2012（9）：112－114.

[14]印芳，彭克勤，葛紅，等.礦質(zhì)元素對(duì)蝴蝶蘭組培褐變的影響[J].北方園藝，2006（6）：137－139.