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    普陀樟SRAP-PCR反應體系的建立

    2014-11-24 02:08:10呂昕謠趙國淼曾燕如宋緒忠
    浙江林業(yè)科技 2014年3期
    關鍵詞:普陀多態(tài)性基因組

    呂昕謠,趙 穎,趙國淼,曾燕如*,宋緒忠,楊 華

    (1.浙江農林大學 亞熱帶森林培育國家重點實驗室培育基地,浙江 臨安 311300;2.浙江省舟山市林業(yè)科學研究院,浙江 舟山 316000;3.浙江省林業(yè)科學研究院,浙江 杭州 310023)

    普陀樟(Cinnamomum japonicumvar.chenii)系樟科樟屬常綠喬木,為舟山海島特有瀕危植物。集中分布在舟山市普陀區(qū)的普陀山、朱家尖及其毗鄰的懸水小島上,除此之外的其他區(qū)域均未見有該樹種的天然分布[1]。普陀樟木材堅實致密,紋理通直,耐腐,耐水濕,是優(yōu)良的用材樹種;且根系發(fā)達,抗風性強,且兼具耐鹽堿、耐干旱瘠薄等特性,適應性廣,非常適宜沿海地區(qū)栽種。而目前卻缺乏對野生普陀樟致瀕原因等各方面的足夠了解,難以實施有效的遺傳保育。

    相關序列擴增多態(tài)性(Sequence-related amplifiedpolymorphism, SRAP)是Li和Quiros[2]開發(fā)的分子標記技術,該技術通過獨特的引物設計對開放閱讀框(Open reading frames, ORFs)進行擴增,因個體不同以及物種的內含子、啟動子與間隔區(qū)長度不等而產生多態(tài)性[3]。Ferriol等[4]在觀賞南瓜(Cucurbita moschata)中利用SRAP和AFLP兩種分子標記進行遺傳多樣性實驗,結果與AFLP標記相比,SRAP標記結果更接近其性狀變異。Budak[5]等對野牛草(Buchloe dactyloides)進行ISSR(Inter-simple Sequence Repeat)、SSR(Simple Sequence Repeat)、RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA)和SRAP等4種分子標記的遺傳多樣性研究,結果SRAP表現(xiàn)出更豐富的遺傳多樣性,是區(qū)分能力最強的標記。與其他分子標記相比,SRAP標記技術具有重復性好、多態(tài)性高、操作簡便、共顯性、易測序、引物具有通用性等優(yōu)越性,已逐漸成為種質資源研究的有效技術,近年來多應用于遺傳多樣性分析[5]、遺傳圖譜構建[6]以及重要性狀標記[7]等諸多領域。

    目前,有關普陀樟分子標記方面的研究尚未見報道。本研究建立了普陀樟的SRAP-PCR反應體系,可為進一步開展普陀樟的遺傳多樣性及相關遺傳研究提供技術支撐,也可為普陀樟基因組分析、分子標記輔助育種等奠定基礎。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    新鮮健康的普陀樟葉片樣品7份采自舟山群島不同島嶼,帶回實驗室后清水洗凈,放置-40℃冰箱保存待用。

    表1 SRAP 引物序列Table1 Sequences of SRAP primers

    Taq DNA聚合酶(5U/μL)購自上海申能博彩生物科技有限公司;dNTP、DNA Marker(Fermentas)、SRAP 引物(表1)等均購自生工生物工程(上海)有限公司。

    1.2 方法

    1.2.1 基因組DNA的提取與檢測 采用改良CTAB方法結合TNE的方法[8]提取普陀樟基因組DNA。提取的DNA用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性,用紫外分光光度計(NanoDrop 1000 Spectrophotometer,美國)測定A260、A280,并計算兩者的比值,以檢驗DNA的質量,并根據測定的濃度將DNA稀釋到10 ng/μL,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2.2 SRAP-PCR反應體系的建立 基于劉浩凱等優(yōu)化的適用于榧樹的SRAP分析方法(含PCR產物電泳)[9]采用L16(45)正交試驗設計,對可能影響普陀樟SRAP-PCR反應的Mg2+濃度、dNTPS、Taq DNA聚合酶、引物(F2/R4)和模板DNA用量進行5因素4水平正交試驗(表2)。反應總體積為20 μL,實驗重復4次,以確定最佳體系組合。

    表2 SRAP-PCR正交設計試驗L16(45)Table2 L16(45)orthogonal design for SRAP-PCR reaction

    反應程序為94℃預變性5 min;共5個循環(huán),每個循環(huán)94℃變性45s,35℃退火45s,72℃延伸1 min;隨后35個循環(huán),每個循環(huán)94℃變性45 s,50℃退火45s,72℃延伸1 min;最后72℃延伸5 min,4℃保存。擴增產物加入3 μL Loading dye混合均勻,以3 000 bp DNA Ladder為參照標準,采用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠進行電泳,160V電泳85 min。電泳結束后采用銀染法進行染色,顯色后將凝膠置于可見光燈箱上觀察電泳結果,并拍照保存。

    隨機選取F6/R7和F6/R8兩個引物組合,利用篩選出的普陀樟最優(yōu)體系,對30份普陀樟DNA材料進行PCR擴增,檢測反應體系的穩(wěn)定性。

    利用優(yōu)化設計確定的SRAP-PCR的最佳反應體系,用表1所示的10個正向引物和10個反向引物組合的100對引物,對4個不同普陀樟樣品進行引物組合篩選。

    2 結果與分析

    2.1 普陀樟基因組DNA的提取

    經紫外分光光度計測定,8份普陀樟DNA樣品OD260/OD280值均在1.8 ~ 2.0;1%瓊脂糖電泳檢測結果(圖1)顯示,DNA條帶完整清晰,無拖尾現(xiàn)象,符合分子標記擴增對DNA的要求。

    圖1 普陀樟DNA的瓊脂糖電泳檢測圖Figure1 Argarose electrophoretogram of genomic DNAs extracted in C.japonicum var.chenii

    2.2 SRAP-PCR反應體系的優(yōu)化

    從正交實驗結果可以看出,不同的PCR組份組合擴增效果具有明顯的差異,其中1 ~ 4、7、8號擴增效果不好,11、12、15、16號位點較清楚,但位點數(shù)少,均予以淘汰(圖2)。仔細觀察發(fā)現(xiàn),9、10號比13、14號擴增的位點數(shù)多,而且更加清晰。直觀分析10號組合為佳,9號組合次之,二者間無明顯差異。慮到9號組合中 Taq 酶的用量為 2 U,因此本著經濟有效的原則,最終確定10號組合為最理想的SRAP-PCR反應體系,即20 μL PCR體系包括 2.5 mmol/L Mg2+、0.2 mmol/L dNTPs、1.5 U Taq DNA聚合酶、0.4 μmol/L引物、10 ng模板DNA、2 μL 10×PCR buffer。

    圖2 正交實驗產物電泳圖Figure2 Electrophoretogram of PCR products based on the orthogonal design

    2.3 SRAP-PCR體系的穩(wěn)定性檢測及引物篩選

    SRAP-PCR體系的穩(wěn)定性檢測表明,擴增譜帶清晰而穩(wěn)定,位點數(shù)多,且多態(tài)性豐富(圖3),說明建立的反應體系具有良好的穩(wěn)定性,適合于普陀樟的SRAP-PCR分析。利用該反應體系,從100對引物組合(表1)中篩選出20對擴增產物清晰、多態(tài)性較好的引物(F2R7、F3R7、F4R7、F5R7、F6R7、F8R7、F9R7、F5R1、F5R8、F6R8、F9R6、F2R1、F4R2、F5R1、F5R2、F3R3、F4R3、F6R4、F10R4、F5R5),用于普陀樟后續(xù)遺傳多樣性分析。

    圖3 SRAP反應體系穩(wěn)定性檢測(引物對:上:F6R7;下:F6R8)Figure3 Testing of the SRAP reaction (Primer pairs: F6R7 (up) and F6R8(down))

    3 結論與討論

    SRAP分子標記是基于PCR反應的一種標記技術,它的結果受到體系中各個因素的影響,且各因素之間還存在相互作用,因此各因素之間的配比只有達到最佳狀態(tài)時,才能得到穩(wěn)定、可重復的擴增結果。不同植物適合的SRAP 反應體系不同,所以需要根據物種的不同對反應體系進行優(yōu)化。

    本實驗采用了一次性正交實驗設計篩選反應體系,并對該體系穩(wěn)定性進行了檢測及初步應用,結果顯示擴增位點清晰穩(wěn)定,多態(tài)性好,重復性強,說明本研究建立的普陀樟SRAP-PCR體系穩(wěn)定可靠、擴增效率高,為日后普陀樟基因組分析、分子標記輔助育種、遺傳多樣性研究等奠定了基礎。

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