1株亞硒酸鈉還原菌的分離及初步研究

王健等

摘要：從湖北恩施漁塘壩高硒土壤中分離篩選出1株能夠還原Na2SeO3的細(xì)菌EGS12，16S rDNA測(cè)序鑒定為嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌。開展Na2SeO3對(duì)細(xì)菌菌株生長(zhǎng)影響的試驗(yàn)研究，結(jié)果表明，該菌株在2 mmol/L Na2SeO3的LB培養(yǎng)基中 37 ℃ 搖床培養(yǎng)87 h，對(duì)Na2SeO3的還原率為97.31%。

關(guān)鍵詞：亞硒酸鈉；亞硒酸鹽；還原；寡養(yǎng)單胞菌

中圖分類號(hào)： Q93-331文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2014）10-0370-03

收稿日期：2013-12-19

作者簡(jiǎn)介：王?。?989—），男，湖南衡陽人，碩士，從事生物資源綜合利用研究。E-mail：260598984@qq.com。

通信作者：吳永堯，教授。E-mail：yywu357@sohu.com。硒是一種生命必需微量元素，但高濃度的硒毒性較強(qiáng)，容易造成環(huán)境污染。湖北恩施漁塘壩是中國(guó)典型高硒地區(qū)之一，也是世界上發(fā)生過人群硒中毒的暴發(fā)性流行病區(qū)。在硒4種價(jià)態(tài)中（分別為-2、0、+4、+6），亞硒酸鹽的毒性最大，是污染環(huán)境的主要物質(zhì)之一[1-2]。亞硒酸鹽還原菌可以將亞硒酸鹽還原為紅色的單質(zhì)硒，可用于某些硒環(huán)境污染的生物治理，其產(chǎn)物單質(zhì)硒在生物補(bǔ)硒方面也有應(yīng)用價(jià)值。另外，單質(zhì)納米硒有很活躍的光學(xué)電子特性，是未來“納米技術(shù)”的良好研究材料[3]。嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌是一種在自然界廣泛分布的非發(fā)酵型革蘭氏陰性桿菌，是人類一種重要條件致病菌[4]，學(xué)者們大多集中在醫(yī)學(xué)如耐藥性、致病機(jī)制等方面開展研究，尚未有寡養(yǎng)單胞菌具有還原Na2SeO3能力的研究報(bào)道。

1材料與方法

1.1主要儀器和試劑

16S rDNA細(xì)菌通用引物27-F：5′-GAG AGT TTG ATC CTG GCT CAG-3′，1392-R：5′-ACG GGC GGT GTG TRC-3′，由北京六合華大基因股份有限公司合成；單質(zhì)硒粉，純度為99.9%；亞硒酸鈉（Na2SeO3）及其他化學(xué)試劑，均為分析純；TU-1810紫外可見分光光度計(jì)，由北京普析通用有限公司生產(chǎn)。

1.2土樣采集及處理

1.2.1樣品采集土樣2013年9月采自湖北省恩施市新塘鄉(xiāng)漁塘壩，以東經(jīng)109°46′19″～109°47′24″、北緯30°10′24″～30°11′02″ 的硒礦洞為起點(diǎn)，向北每間隔500 m采集1個(gè)土樣，深度為5～25 cm。記錄上層植被情況，多點(diǎn)采樣混合。

1.2.2樣品處理及保存壓碎，去除石塊、植物、根莖、落葉等，混勻，裝入聚乙烯自封袋中，于冰盒中運(yùn)輸及保存。

1.3培養(yǎng)條件及分離方法

2.5菌株還原能力初探

由圖4可見，在12～48 h內(nèi)，菌株EGS12對(duì)Na2SeO3的還原率提升并不明顯，48 h后還原率大大提升。菌株EGS12對(duì)Na2SeO3的還原是從生長(zhǎng)就開始的，到了穩(wěn)定期后進(jìn)行大量還原，這說明菌株對(duì)Na2SeO3的還原和菌體生長(zhǎng)呈正相關(guān)性。

3結(jié)論與討論

硒是一種營(yíng)養(yǎng)劑量和毒性劑量范圍很窄的微量元素[7]。

利用微生物還原Na2SeO3而產(chǎn)生納米紅色單質(zhì)硒，比傳統(tǒng)無機(jī)硒和有機(jī)硒更高效、更具有高安全性。本研究從高硒區(qū)土壤分離篩選到高耐硒和高還原率的嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌，能在耗氧情況下利用有機(jī)碳源，把培養(yǎng)基所含的Na2SeO3還原成紅色單質(zhì)硒。當(dāng)LB培養(yǎng)基中添加2 mmol/LNa2SeO3時(shí)，僅用4 d不到的時(shí)間就幾乎把Na2SeO3全部還原完。雖然Na2SeO3對(duì)微生物都有毒性作用，但菌株EGS12竟然能生長(zhǎng)在60 mmol/L篩選分離平板中，其耐硒能力遠(yuǎn)高于其他還原硒菌種，如枯草芽孢桿菌MIC為1 mmol/L、大腸桿菌MIC為5.8 mmol/L、慢生大豆根瘤菌MIC為6～12 mmol/L、球型紅細(xì)菌MIC為2.9～4.6 mmol/L等[8]。 經(jīng)鑒定，篩選出的菌株為嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌，其還原Na2SeO3的能力國(guó)內(nèi)尚未見報(bào)道，對(duì)Na2SeO3的還原位點(diǎn)及還原機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]王東亮，肖敏，錢衛(wèi)，等. 細(xì)菌還原氧化態(tài)硒產(chǎn)生紅色單質(zhì)硒的研究進(jìn)展[J]. 微生物學(xué)報(bào)，2007，47（3）：554-557.

[2]Zhang J S，Wang H L，Bao Y P，et al. Nano red elemental selenium has no size effect in the induction of seleno-enzymes in both cultured cells and mice[J]. Life Sciences，2004，75（2）：237-244.

[3]高學(xué)云，張勁松，張立德. 納米紅色元素硒的急性毒性和生物利用性[J]. 衛(wèi)生研究，2000，29（1）：57-58.

[4]Denton M，Kerr K G. Microbiological and clinical aspects of infection associated with Stenotrophomonas maltophilia[J]. Clinical Microbio-logy Reviews，1998，11（1）：57-80.

[5]Biswas K C，Barton L L，Tsui W L，et al. A novel method for the measurement of elemental selenium produced by bacterial reduction of selenite[J]. Journal of Microbiological Methods，2011，86（2）：140-144.

[6]耿毅，汪開毓，陳德芳，等. 嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌研究進(jìn)展[J]. 動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2006，27（5）：28-31.

[7]鄭世學(xué)，粟靜，王瑞，等. 硒是雙刃劍？——談微生物中的硒代謝[J]. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，32（5）：1-8.

[8]蔣華東，何曉紅，張禮霞，等. 一株假單胞菌好氧還原亞硒酸鈉為紅色單質(zhì)硒[J]. 微生物學(xué)報(bào)，2010，50（10）：1347-1352.

摘要：從湖北恩施漁塘壩高硒土壤中分離篩選出1株能夠還原Na2SeO3的細(xì)菌EGS12，16S rDNA測(cè)序鑒定為嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌。開展Na2SeO3對(duì)細(xì)菌菌株生長(zhǎng)影響的試驗(yàn)研究，結(jié)果表明，該菌株在2 mmol/L Na2SeO3的LB培養(yǎng)基中 37 ℃ 搖床培養(yǎng)87 h，對(duì)Na2SeO3的還原率為97.31%。

關(guān)鍵詞：亞硒酸鈉；亞硒酸鹽；還原；寡養(yǎng)單胞菌

中圖分類號(hào)： Q93-331文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2014）10-0370-03

收稿日期：2013-12-19

作者簡(jiǎn)介：王健（1989—），男，湖南衡陽人，碩士，從事生物資源綜合利用研究。E-mail：260598984@qq.com。

通信作者：吳永堯，教授。E-mail：yywu357@sohu.com。硒是一種生命必需微量元素，但高濃度的硒毒性較強(qiáng)，容易造成環(huán)境污染。湖北恩施漁塘壩是中國(guó)典型高硒地區(qū)之一，也是世界上發(fā)生過人群硒中毒的暴發(fā)性流行病區(qū)。在硒4種價(jià)態(tài)中（分別為-2、0、+4、+6），亞硒酸鹽的毒性最大，是污染環(huán)境的主要物質(zhì)之一[1-2]。亞硒酸鹽還原菌可以將亞硒酸鹽還原為紅色的單質(zhì)硒，可用于某些硒環(huán)境污染的生物治理，其產(chǎn)物單質(zhì)硒在生物補(bǔ)硒方面也有應(yīng)用價(jià)值。另外，單質(zhì)納米硒有很活躍的光學(xué)電子特性，是未來“納米技術(shù)”的良好研究材料[3]。嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌是一種在自然界廣泛分布的非發(fā)酵型革蘭氏陰性桿菌，是人類一種重要條件致病菌[4]，學(xué)者們大多集中在醫(yī)學(xué)如耐藥性、致病機(jī)制等方面開展研究，尚未有寡養(yǎng)單胞菌具有還原Na2SeO3能力的研究報(bào)道。

1材料與方法

1.1主要儀器和試劑

16S rDNA細(xì)菌通用引物27-F：5′-GAG AGT TTG ATC CTG GCT CAG-3′，1392-R：5′-ACG GGC GGT GTG TRC-3′，由北京六合華大基因股份有限公司合成；單質(zhì)硒粉，純度為99.9%；亞硒酸鈉（Na2SeO3）及其他化學(xué)試劑，均為分析純；TU-1810紫外可見分光光度計(jì)，由北京普析通用有限公司生產(chǎn)。

1.2土樣采集及處理

1.2.1樣品采集土樣2013年9月采自湖北省恩施市新塘鄉(xiāng)漁塘壩，以東經(jīng)109°46′19″～109°47′24″、北緯30°10′24″～30°11′02″ 的硒礦洞為起點(diǎn)，向北每間隔500 m采集1個(gè)土樣，深度為5～25 cm。記錄上層植被情況，多點(diǎn)采樣混合。

1.2.2樣品處理及保存壓碎，去除石塊、植物、根莖、落葉等，混勻，裝入聚乙烯自封袋中，于冰盒中運(yùn)輸及保存。

1.3培養(yǎng)條件及分離方法

2.5菌株還原能力初探

由圖4可見，在12～48 h內(nèi)，菌株EGS12對(duì)Na2SeO3的還原率提升并不明顯，48 h后還原率大大提升。菌株EGS12對(duì)Na2SeO3的還原是從生長(zhǎng)就開始的，到了穩(wěn)定期后進(jìn)行大量還原，這說明菌株對(duì)Na2SeO3的還原和菌體生長(zhǎng)呈正相關(guān)性。

3結(jié)論與討論

硒是一種營(yíng)養(yǎng)劑量和毒性劑量范圍很窄的微量元素[7]。

利用微生物還原Na2SeO3而產(chǎn)生納米紅色單質(zhì)硒，比傳統(tǒng)無機(jī)硒和有機(jī)硒更高效、更具有高安全性。本研究從高硒區(qū)土壤分離篩選到高耐硒和高還原率的嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌，能在耗氧情況下利用有機(jī)碳源，把培養(yǎng)基所含的Na2SeO3還原成紅色單質(zhì)硒。當(dāng)LB培養(yǎng)基中添加2 mmol/LNa2SeO3時(shí)，僅用4 d不到的時(shí)間就幾乎把Na2SeO3全部還原完。雖然Na2SeO3對(duì)微生物都有毒性作用，但菌株EGS12竟然能生長(zhǎng)在60 mmol/L篩選分離平板中，其耐硒能力遠(yuǎn)高于其他還原硒菌種，如枯草芽孢桿菌MIC為1 mmol/L、大腸桿菌MIC為5.8 mmol/L、慢生大豆根瘤菌MIC為6～12 mmol/L、球型紅細(xì)菌MIC為2.9～4.6 mmol/L等[8]。 經(jīng)鑒定，篩選出的菌株為嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌，其還原Na2SeO3的能力國(guó)內(nèi)尚未見報(bào)道，對(duì)Na2SeO3的還原位點(diǎn)及還原機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]王東亮，肖敏，錢衛(wèi)，等. 細(xì)菌還原氧化態(tài)硒產(chǎn)生紅色單質(zhì)硒的研究進(jìn)展[J]. 微生物學(xué)報(bào)，2007，47（3）：554-557.

[2]Zhang J S，Wang H L，Bao Y P，et al. Nano red elemental selenium has no size effect in the induction of seleno-enzymes in both cultured cells and mice[J]. Life Sciences，2004，75（2）：237-244.

[3]高學(xué)云，張勁松，張立德. 納米紅色元素硒的急性毒性和生物利用性[J]. 衛(wèi)生研究，2000，29（1）：57-58.

[4]Denton M，Kerr K G. Microbiological and clinical aspects of infection associated with Stenotrophomonas maltophilia[J]. Clinical Microbio-logy Reviews，1998，11（1）：57-80.

[5]Biswas K C，Barton L L，Tsui W L，et al. A novel method for the measurement of elemental selenium produced by bacterial reduction of selenite[J]. Journal of Microbiological Methods，2011，86（2）：140-144.

[6]耿毅，汪開毓，陳德芳，等. 嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌研究進(jìn)展[J]. 動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2006，27（5）：28-31.

[7]鄭世學(xué)，粟靜，王瑞，等. 硒是雙刃劍？——談微生物中的硒代謝[J]. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，32（5）：1-8.

[8]蔣華東，何曉紅，張禮霞，等. 一株假單胞菌好氧還原亞硒酸鈉為紅色單質(zhì)硒[J]. 微生物學(xué)報(bào)，2010，50（10）：1347-1352.

摘要：從湖北恩施漁塘壩高硒土壤中分離篩選出1株能夠還原Na2SeO3的細(xì)菌EGS12，16S rDNA測(cè)序鑒定為嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌。開展Na2SeO3對(duì)細(xì)菌菌株生長(zhǎng)影響的試驗(yàn)研究，結(jié)果表明，該菌株在2 mmol/L Na2SeO3的LB培養(yǎng)基中 37 ℃ 搖床培養(yǎng)87 h，對(duì)Na2SeO3的還原率為97.31%。

關(guān)鍵詞：亞硒酸鈉；亞硒酸鹽；還原；寡養(yǎng)單胞菌

中圖分類號(hào)： Q93-331文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2014）10-0370-03

收稿日期：2013-12-19

作者簡(jiǎn)介：王?。?989—），男，湖南衡陽人，碩士，從事生物資源綜合利用研究。E-mail：260598984@qq.com。

通信作者：吳永堯，教授。E-mail：yywu357@sohu.com。硒是一種生命必需微量元素，但高濃度的硒毒性較強(qiáng)，容易造成環(huán)境污染。湖北恩施漁塘壩是中國(guó)典型高硒地區(qū)之一，也是世界上發(fā)生過人群硒中毒的暴發(fā)性流行病區(qū)。在硒4種價(jià)態(tài)中（分別為-2、0、+4、+6），亞硒酸鹽的毒性最大，是污染環(huán)境的主要物質(zhì)之一[1-2]。亞硒酸鹽還原菌可以將亞硒酸鹽還原為紅色的單質(zhì)硒，可用于某些硒環(huán)境污染的生物治理，其產(chǎn)物單質(zhì)硒在生物補(bǔ)硒方面也有應(yīng)用價(jià)值。另外，單質(zhì)納米硒有很活躍的光學(xué)電子特性，是未來“納米技術(shù)”的良好研究材料[3]。嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌是一種在自然界廣泛分布的非發(fā)酵型革蘭氏陰性桿菌，是人類一種重要條件致病菌[4]，學(xué)者們大多集中在醫(yī)學(xué)如耐藥性、致病機(jī)制等方面開展研究，尚未有寡養(yǎng)單胞菌具有還原Na2SeO3能力的研究報(bào)道。

1材料與方法

1.1主要儀器和試劑

16S rDNA細(xì)菌通用引物27-F：5′-GAG AGT TTG ATC CTG GCT CAG-3′，1392-R：5′-ACG GGC GGT GTG TRC-3′，由北京六合華大基因股份有限公司合成；單質(zhì)硒粉，純度為99.9%；亞硒酸鈉（Na2SeO3）及其他化學(xué)試劑，均為分析純；TU-1810紫外可見分光光度計(jì)，由北京普析通用有限公司生產(chǎn)。

1.2土樣采集及處理

1.2.1樣品采集土樣2013年9月采自湖北省恩施市新塘鄉(xiāng)漁塘壩，以東經(jīng)109°46′19″～109°47′24″、北緯30°10′24″～30°11′02″ 的硒礦洞為起點(diǎn)，向北每間隔500 m采集1個(gè)土樣，深度為5～25 cm。記錄上層植被情況，多點(diǎn)采樣混合。

1.2.2樣品處理及保存壓碎，去除石塊、植物、根莖、落葉等，混勻，裝入聚乙烯自封袋中，于冰盒中運(yùn)輸及保存。

1.3培養(yǎng)條件及分離方法

2.5菌株還原能力初探

由圖4可見，在12～48 h內(nèi)，菌株EGS12對(duì)Na2SeO3的還原率提升并不明顯，48 h后還原率大大提升。菌株EGS12對(duì)Na2SeO3的還原是從生長(zhǎng)就開始的，到了穩(wěn)定期后進(jìn)行大量還原，這說明菌株對(duì)Na2SeO3的還原和菌體生長(zhǎng)呈正相關(guān)性。

3結(jié)論與討論

硒是一種營(yíng)養(yǎng)劑量和毒性劑量范圍很窄的微量元素[7]。

利用微生物還原Na2SeO3而產(chǎn)生納米紅色單質(zhì)硒，比傳統(tǒng)無機(jī)硒和有機(jī)硒更高效、更具有高安全性。本研究從高硒區(qū)土壤分離篩選到高耐硒和高還原率的嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌，能在耗氧情況下利用有機(jī)碳源，把培養(yǎng)基所含的Na2SeO3還原成紅色單質(zhì)硒。當(dāng)LB培養(yǎng)基中添加2 mmol/LNa2SeO3時(shí)，僅用4 d不到的時(shí)間就幾乎把Na2SeO3全部還原完。雖然Na2SeO3對(duì)微生物都有毒性作用，但菌株EGS12竟然能生長(zhǎng)在60 mmol/L篩選分離平板中，其耐硒能力遠(yuǎn)高于其他還原硒菌種，如枯草芽孢桿菌MIC為1 mmol/L、大腸桿菌MIC為5.8 mmol/L、慢生大豆根瘤菌MIC為6～12 mmol/L、球型紅細(xì)菌MIC為2.9～4.6 mmol/L等[8]。 經(jīng)鑒定，篩選出的菌株為嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌，其還原Na2SeO3的能力國(guó)內(nèi)尚未見報(bào)道，對(duì)Na2SeO3的還原位點(diǎn)及還原機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]王東亮，肖敏，錢衛(wèi)，等. 細(xì)菌還原氧化態(tài)硒產(chǎn)生紅色單質(zhì)硒的研究進(jìn)展[J]. 微生物學(xué)報(bào)，2007，47（3）：554-557.

[2]Zhang J S，Wang H L，Bao Y P，et al. Nano red elemental selenium has no size effect in the induction of seleno-enzymes in both cultured cells and mice[J]. Life Sciences，2004，75（2）：237-244.

[3]高學(xué)云，張勁松，張立德. 納米紅色元素硒的急性毒性和生物利用性[J]. 衛(wèi)生研究，2000，29（1）：57-58.

[4]Denton M，Kerr K G. Microbiological and clinical aspects of infection associated with Stenotrophomonas maltophilia[J]. Clinical Microbio-logy Reviews，1998，11（1）：57-80.

[5]Biswas K C，Barton L L，Tsui W L，et al. A novel method for the measurement of elemental selenium produced by bacterial reduction of selenite[J]. Journal of Microbiological Methods，2011，86（2）：140-144.

[6]耿毅，汪開毓，陳德芳，等. 嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌研究進(jìn)展[J]. 動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2006，27（5）：28-31.

[7]鄭世學(xué)，粟靜，王瑞，等. 硒是雙刃劍？——談微生物中的硒代謝[J]. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，32（5）：1-8.

[8]蔣華東，何曉紅，張禮霞，等. 一株假單胞菌好氧還原亞硒酸鈉為紅色單質(zhì)硒[J]. 微生物學(xué)報(bào)，2010，50（10）：1347-1352.