鎳鉻合金的細(xì)胞毒性及對(duì)L929細(xì)胞Bax和Bcl-2表達(dá)的影響

孟 賀，孫 萌，張文茹，徐 強(qiáng)，李湛潔

(1河北聯(lián)合大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院修復(fù)教研室，唐山 063000;2河北聯(lián)合大學(xué)附屬醫(yī)院超聲科;3唐山市協(xié)和醫(yī)院口腔科;4唐山市婦幼保健醫(yī)院口腔科;*通訊作者，E-mail:menghe10.2@163.com)

鎳鉻合金由于其機(jī)械性能優(yōu)良、制作簡(jiǎn)單、價(jià)格低廉，在口腔修復(fù)領(lǐng)域得到了很廣泛的應(yīng)用。近年來(lái)，人們?cè)絹?lái)越關(guān)注鎳鉻合金應(yīng)用后的生物安全性問(wèn)題及鎳鉻合金在口腔復(fù)雜環(huán)境下的離子釋放行為。關(guān)于其可能引起的細(xì)胞損傷、局部組織和全身毒性反應(yīng)等問(wèn)題已有較多的研究，而關(guān)于鎳鉻合金對(duì)凋亡相關(guān)蛋白Bax和Bcl-2表達(dá)的影響報(bào)道較少。本文選用臨床上牙科修復(fù)常用鎳鉻合金材料作為研究對(duì)象，檢測(cè)鎳鉻合金金屬離子對(duì)小鼠成纖維細(xì)胞L929凋亡相關(guān)蛋白Bax和Bcl-2表達(dá)的影響，探討鎳鉻合金金屬離子與細(xì)胞凋亡的關(guān)系。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 細(xì)胞系

小鼠成纖維細(xì)胞L929，由天津塞爾生物技術(shù)有限公司細(xì)胞所提供。

1.2 試件的制作及浸提液的制備

精密鑄造規(guī)格為15 mm×15 mm×2 mm的鎳鉻合金(Stellite，上海)試件8個(gè)，打磨拋光后，超聲清洗15 min。去離子水沖洗數(shù)遍后置于玻璃小瓶中，將金屬片于121℃高壓滅菌后置于6孔板中。以含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液為浸提介質(zhì)，按照試件表面積與浸提液體積比值為1.25×1 000 cm2/L的標(biāo)準(zhǔn)［1］，將浸提介質(zhì)加入6孔板中，在37℃、5%CO2條件下連續(xù)浸提7 d，制備浸提液待用。

1.3 試劑和儀器

RPMI1640培養(yǎng)基(Gibco，美國(guó))，胎牛血清(TBD，天津)，細(xì)胞培養(yǎng)箱(HERA Cell 150，Heraeu，德國(guó))，倒置相差顯微鏡(Olympus，日本)，胰蛋白酶(GIBCO，美國(guó))，兔抗鼠Bcl-2多克隆抗體(博奧森，北京)，兔抗鼠Bax多克隆抗體(博奧森，北京)、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG(博奧森，北京)、免疫組化試劑盒(PV6001，天津)。

1.4 L929細(xì)胞的生長(zhǎng)代謝曲線

用0.25%胰蛋白酶消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的L929細(xì)胞，分別以(1－10)×107個(gè)/L的細(xì)胞濃度接種于96孔板，每個(gè)濃度接種8個(gè)孔，然后將培養(yǎng)板置于孵箱中，在37℃、5%CO2、95%濕度的培養(yǎng)箱中，孵育72 h。加入5 g/L MTT溶液(每孔20μl)繼續(xù)培養(yǎng)4 h，倒掉原液，PBS清洗后加入二甲亞砜(每孔150μl)室溫下振蕩20 min。在490 nm波長(zhǎng)下用酶聯(lián)檢測(cè)儀檢測(cè)吸光度(A值)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)鎳鉻合金細(xì)胞毒性

根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)代謝曲線確定L929細(xì)胞濃度，接種于96孔板，培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁后，倒掉原培養(yǎng)液并將其分為鎳鉻合金組與陰性對(duì)照組，分別加入鎳鉻合金浸提液及含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，每組8個(gè)孔。培養(yǎng)48 h后，用酶聯(lián)檢測(cè)儀在波長(zhǎng)490 nm條件下測(cè)各組吸光度(A)值，計(jì)算細(xì)胞相對(duì)增殖率(relative growth rate，RGR)，公式:RGR=(鎳鉻合金組A值/陰性對(duì)照組A值)×100%。根據(jù)毒性分級(jí)法評(píng)分:0級(jí)，細(xì)胞增殖率為≥100%;1級(jí)，75%－99%;2 級(jí)，50%－74%;3 級(jí)，25%－49%;4級(jí)，1%－24%;5級(jí)，0%。

1.6 免疫組化反應(yīng)檢測(cè)Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)

實(shí)驗(yàn)分為鎳鉻合金組Bax、陰性對(duì)照組Bax、鎳鉻合金組Bcl-2及陰性對(duì)照組Bcl-2，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的小鼠成纖維細(xì)胞L929以6×107個(gè)/L的濃度接種于放有蓋玻片的6孔板中，加入含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h。待細(xì)胞貼壁后棄去原培養(yǎng)基，分別加入鎳鉻合金浸提液及含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，每組設(shè)立兩個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)48 h。按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，鏡下觀察并拍攝照片。每張切片隨機(jī)選取3個(gè)視野，Bax及Bcl-2在細(xì)胞質(zhì)中呈棕黃色染色為陽(yáng)性表達(dá)，以細(xì)胞未著色為陰性。在高倍鏡(×400)下拍攝照片，并采用Image pro plus 6.0醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)對(duì)Bax及Bcl-2蛋白表達(dá)強(qiáng)度進(jìn)行半定量分析。Bax、Bcl-2陽(yáng)性反應(yīng)為胞質(zhì)染成黃到棕黃顆粒和彌漫成片，陰性反應(yīng)為細(xì)胞胞質(zhì)未著色。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 L929細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線

對(duì)3次細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，在L929細(xì)胞的接種濃度為(1－7)×107個(gè)/L時(shí)，細(xì)胞的增殖率與濃度呈正的直線相關(guān)(t=35.49，P＜0.05，見(jiàn)圖1)。根據(jù)生長(zhǎng)曲線的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在 MTT實(shí)驗(yàn)中選取細(xì)胞的接種濃度為6×107個(gè)/L，接種于96孔板。

圖1 3次生長(zhǎng)曲線實(shí)驗(yàn)中接種細(xì)胞量與A值的關(guān)系Figure 1 Relationship between incubated cells and ODin growth curve

圖2 兩組Bax及Bcl-2蛋白的表達(dá)情況Figure 2 The expression of Bax and Bcl-2 in two groups

2.2 細(xì)胞增殖率檢測(cè)

在MTT實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)鎳鉻合金組的細(xì)胞增殖率＞100%(見(jiàn)表1)，細(xì)胞毒性為0級(jí)。

表1 MTT實(shí)驗(yàn)中各組細(xì)胞增殖率比較Table 1 Cell proliferation in two groups by MTT

2.3 Bax、Bcl-2 免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

采用Image pro plus 6.0醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)對(duì)Bax和Bcl-2表達(dá)強(qiáng)度進(jìn)行半定量分析，鎳鉻合金組與陰性對(duì)照組的Bax及 Bcl-2表達(dá)情況，及 Bax/Bcl-2光密度比值見(jiàn)圖2(見(jiàn)第1003頁(yè))，表2。鎳鉻合金組Bax的表達(dá)高于陰性對(duì)照組，兩組Bax的表達(dá)及Bax/Bcl-2的比值統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著(t值分別為2.841及5.365，P＜0.05);兩組 Bcl-2 的表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=0.862，P＞0.05)。

表2 Bax及Bcl-2的光密度值及Bax/Bcl-2比值Table 2 OD value of Bax and Bcl-2 expression and their ratio

3 討論

近些年，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)生物相容性的評(píng)價(jià)方法進(jìn)行了大量研究，并且逐步傾向于利用現(xiàn)代分子生物學(xué)手段對(duì)生物材料的安全性進(jìn)行客觀有效的評(píng)價(jià)，使評(píng)價(jià)方法從整體水平到細(xì)胞水平再深入到分子水平，希望在分子水平上建立評(píng)價(jià)材料生物相容性的標(biāo)準(zhǔn)。戴建國(guó)等［2］研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞周期檢測(cè)可為生物材料的生物相容性評(píng)價(jià)提供新的思路和方法，并有望成為生物材料生物相容性評(píng)價(jià)研究的重要指標(biāo)之一;洪巖松等［3］研究發(fā)現(xiàn)在時(shí)間梯度輔助下用caspase-3活化度評(píng)價(jià)4種齒科合金生物相容性，其結(jié)果與MTT法一致，可作為評(píng)價(jià)生物相容性的指標(biāo)之一。從分子水平評(píng)價(jià)醫(yī)用生物材料的安全性與有效性將成為未來(lái)生物材料領(lǐng)域的研究重點(diǎn)和前沿課題［4］。

生物材料必須具備良好的生物相容性才能確保臨床應(yīng)用的安全性［5］，許多生物材料的制備技術(shù)已經(jīng)相當(dāng)成熟，能夠成功地應(yīng)用于人體。然而，生物材料生物相容性的評(píng)價(jià)方法，仍有待進(jìn)一步完善［6］。目前，關(guān)于生物材料生物相容性的評(píng)價(jià)方法主要包括體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和體外實(shí)驗(yàn)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)是在動(dòng)物體內(nèi)植入生物材料，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間后，處死動(dòng)物進(jìn)行組織觀察的方法。該法能夠很真實(shí)地反映材料與生物體的反應(yīng)情況，對(duì)于材料的臨床應(yīng)用是必要的。但是，需要對(duì)大量的動(dòng)物進(jìn)行長(zhǎng)期觀察，成本較高。體外實(shí)驗(yàn)法是在體外培養(yǎng)細(xì)胞，通過(guò)檢測(cè)與材料作用后的細(xì)胞變化或一些特殊物質(zhì)的產(chǎn)生與否，來(lái)反映材料的生物相容性，最常見(jiàn)的是通過(guò)MTT法檢測(cè)材料對(duì)細(xì)胞增殖的影響而在細(xì)胞水平上評(píng)價(jià)材料的生物相容性。本研究采用MTT實(shí)驗(yàn)的方法，發(fā)現(xiàn)鎳鉻合金對(duì)L929細(xì)胞的增殖無(wú)明顯影響，鎳鉻合金的細(xì)胞毒性為0級(jí)，具有良好的生物相容性。

細(xì)胞凋亡是指由細(xì)胞基因調(diào)控的一種自主性自殺現(xiàn)象;或者說(shuō)細(xì)胞凋亡是細(xì)胞在一定的生理或病理?xiàng)l件下，遵循自身的程序，自我結(jié)束生命的死亡方式。由于這種死亡方式是由基因調(diào)控引發(fā)的，因此也被稱為程序性細(xì)胞死亡(programmed cell death)［7，8］。隨著對(duì)細(xì)胞凋亡研究的深入，發(fā)現(xiàn)線粒體凋亡通路和死亡受體凋亡通路是細(xì)胞凋亡中兩條主要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路［9］。Bcl-2家族蛋白的表達(dá)和調(diào)控是影響細(xì)胞凋亡線粒體通路的關(guān)鍵因素之一，在細(xì)胞凋亡線粒體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中發(fā)揮重要作用。B細(xì)胞淋巴瘤/白血病基因2(Bcl-2)和Bax分別是Bcl-2家族中最具代表性的抑制凋亡和促進(jìn)凋亡基因［10，11］。Bcl-2 蛋白能夠阻遏細(xì)胞凋亡，延長(zhǎng)細(xì)胞的壽命，參與調(diào)控細(xì)胞增殖與凋亡的動(dòng)態(tài)平衡，同細(xì)胞分化、成熟、組織器官的發(fā)育及腫瘤的發(fā)生有著密切的關(guān)系，Bax與Bcl-2相反，能促進(jìn)線粒體促凋亡因子的釋放，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。牙科金屬材料腐蝕析出的金屬離子及其衍生物可引起機(jī)體組織的毒性反應(yīng)，并可引起細(xì)胞凋亡［12，13］。本研究發(fā)現(xiàn)，與陰性對(duì)照組相比，鎳鉻合金浸提液組培養(yǎng)的小鼠成纖維細(xì)胞L929凋亡相關(guān)蛋白Bax表達(dá)增高，Bax/Bcl-2表達(dá)的比值增高，鎳鉻合金誘導(dǎo)小鼠成纖維細(xì)胞L929凋亡相關(guān)蛋白Bax表達(dá)增加。

本研究首先在細(xì)胞水平上通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)鎳鉻合金的細(xì)胞毒性為0級(jí)，然后，在分子水平上通過(guò)免疫組化實(shí)驗(yàn)檢測(cè)鎳鉻合金對(duì)L929細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax及Bcl-2表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)鎳鉻合金可以誘導(dǎo)L929細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax表達(dá)的增高，可能通過(guò)線粒體通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。希望本研究結(jié)果能為將來(lái)在分子生物學(xué)水平上建立評(píng)價(jià)生物材料生物相容性的標(biāo)準(zhǔn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。然而，由于凋亡機(jī)制復(fù)雜，如要進(jìn)一步明確金屬離子與細(xì)胞凋亡的關(guān)系還需更深入的研究。

［1］黃經(jīng)春，由少華，朱雪濤，等.GB/T16886.12－2005/ISO10993－12:2002醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)第12部分:樣品制備與參照樣品［M］.北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2005.

［2］戴建國(guó)，黃培林，郭英，等.細(xì)胞周期檢測(cè)作為生物相容性評(píng)價(jià)指標(biāo)的研究［J］.東南大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，35(2):271－274.

［3］洪巖松，李秀梅，孟賀，等.幾種齒科合金生物相容性的比較［J］.材料研究學(xué)報(bào)，2012，26(2):211－217.

［4］李瑞，王青山.生物材料生物相容性的評(píng)價(jià)方法和發(fā)展趨勢(shì)［J］.中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù)，2011，15(29):5471－5474.

［5］Williams DF.On the mechanisms of biocompatibility［J］.Biomaterials，2008，29(20):2941－2953.

［6］王喜云，王遠(yuǎn)亮.生物材料的生物學(xué)評(píng)價(jià)方法研究進(jìn)展［J］.北京生物醫(yī)學(xué)工程，2007，26(1):95－98.

［7］周建華，叢國(guó)正，高閃電，等.細(xì)胞凋亡的研究進(jìn)展［J］.生物技術(shù)通訊，2008，19(2):274－276.

［8］朱玉山，陳侄.線粒體與細(xì)胞凋亡調(diào)控［J］.生命科學(xué)，2008，20(4):506－513.

［9］賀艷杰，李玉華，盧會(huì)芳，等.線粒體通路和死亡受體通路在中華眼鏡蛇毒組分誘導(dǎo)KG1a細(xì)胞凋亡中的作用［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2013，29(3):356－360.

［10］Rosse T，Olivier R，Monney L，etal.Bcl-2 prolongs cell survival after Bax-induced release of cytochrome C［J］.Nature，1998，391(6666):496－499.

［11］楊連君，曹雪濤，于益.Bcl-2，bax與腫瘤細(xì)胞凋亡［J］.中國(guó)腫瘤生物治療雜志，2003，10(3):232－234.

［12］Lion E，Smits EL，Berneman Z N，etal.Acute myeloid leukemic cell lines loaded with synthetic dsRNA trigger IFN-gamma secretion by human NK cells［J］.Leuk Res，2009，33(4):539－546.

［13］戰(zhàn)德松，呂嬌，趙奇，等.磁性附著體中鐵素體不銹鋼引起小鼠成纖維細(xì)胞L929的死亡模式［J］.金屬學(xué)報(bào)，2006，42(8):892－896.