適于基因芯片實驗的小鼠腦組織RNA提取方法的改進

隋雷鳴，趙煥英，鞏云霞，付文卓，王俐勇*

(1首都醫(yī)科大學 醫(yī)學實驗與測試中心，北京 100069;2山東省莒縣人民醫(yī)院急診科;*通訊作者，E-mail:wly0410@163.com)

目前，基因芯片在科研領域得到廣泛應用，這些應用主要包括基因表達檢測、突變檢測、基因組多態(tài)性分析和基因文庫作圖以及雜交測序等方面。獲取高質量的RNA是進行包括基因芯片、第二代高通量測序、數(shù)字化PCR、cDNA文庫等很多分子生物學研究的必要前提［1-3］?；蛐酒瑢嶒瀸τ赗NA的質量要求較高，這對RNA提取在完整性和純度方面有了更高的要求。由于RNA非常不穩(wěn)定，易被降解，RNA酶無處不在，獲得高純度且完整的RNA并不容易［4，5］。RNA的降解和組織內雜質的殘留，會產生許多偽陰性的結果，芯片結果的可靠性大大降低，會影響實驗結果甚至導致實驗失?。?-9］。

盡管目前已經(jīng)建立起許多RNA分離提取方法，并開發(fā)出若干商品化RNA分離提取試劑盒［10-18］，但對于像基因芯片和高通量測序等高質量要求的樣本，其應用效果還需進一步驗證［6，8］。為了達到提取高質量RNA提取效果的需求，本研究擬以小鼠腦組織為材料，以TissueLyserⅡ高通量組織研磨器為組織破碎勻漿工具，比較目前市面上較常見RNA提取試劑:天根生化科技有限公司組織總RNA提取試劑盒、Ambion公司組織總RNA提取試劑盒和Invitrogen公司的Trizol試劑提取的總RNA和反轉錄后cRNA質量的差異，并對提取方法進行優(yōu)化改進，建立適合于基因芯片實驗的組織高質量RNA提取方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 雄性 BALB/c小鼠(8-10周，SPF級，首都醫(yī)科大學實驗動物部)。

1.1.2 主要試劑 Trizol(Invitrogen公司);試劑盒Ⅰ:RNAprep pure動物組織總RNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司);試劑盒Ⅱ:PureLink?RNA Mini Kit(Ambion公司);試劑盒Ⅲ:Illumina?TotalPrep RNA Amplification Kit(Ambion公司)。

1.2 方法

1.2.1 樣品取材 小鼠分為3組提取總 RNA，每組5只。常規(guī)消毒后，快速斷頭取腦，預冷PBS簡單沖洗后，剪成約20 mg小塊，放入液氮速凍后，保存于-80℃冰箱備用。

1.2.2 總RNA 的提取方法

(1)Trizol法、試劑盒Ⅰ、試劑盒Ⅱ:每樣品加Trizol或裂解液，并放入研磨珠，TissueLyserⅡ高通量組織研磨器高速震蕩研磨，然后分別完全按照Trizol試劑、試劑盒Ⅰ、試劑盒Ⅱ操作說明進行。

(2)試劑盒Ⅰ改良方法:吸附柱CR3置于室溫放置由2 min延長至5 min，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液;吸附柱CR3中加入去蛋白液RW1或漂洗液RW，由直接離心改為室溫放置30 s后再離心;最后向吸附膜的中間部位懸空滴加60μl RNase-Free ddH2O由常溫改為提前60℃預熱，室溫放置2 min，12 000 r/min離心2 min;洗脫次數(shù)由一次改為二次，收集RNA溶液。其余步驟不變。

(3)試劑盒Ⅱ改良方法:吸附柱中加入漂洗液Ⅰ或漂洗液Ⅱ后，由直接離心改為室溫放置30 s后再離心;最后由常溫改為提取60℃預熱的60μl RNase-Free ddH2O洗脫，室溫放置放置時間由1 min延長至2 min，12 000×g離心2 min，洗脫次數(shù)由一次改為二次，收集RNA溶液。其余步驟不變。

(4)試劑盒Ⅲ:每樣品取500 ng總RNA進行反轉錄。反轉錄合成第一條鏈cDNA;第二條鏈cDNA的合成;cDNA純化;體外轉錄合成生物素標記的cRNA;cRNA純化。流程完全按照試劑盒說明書進行，步驟繁多，在此不詳述。

1.2.3 RNA、cRNA 產量、純度和完整性測定RNA電泳分析:完整性RNA可用普通瓊脂糖凝膠電泳，然后以紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察。電泳條件:1%普通瓊脂糖凝膠，0.5×TBE電泳緩沖液，電壓100 V，30 min。

Nanodrop2000分光光度計檢測總RNA和cRNA濃度和純度:吸取待測量樣本1.5μl放在測量基座的表面，測定其在230、260和280 nm處的紫外吸光值。測得濃度值乘以RNA洗脫體積得到總RNA的產量。以 A260/A280、A260/A230比值做純度分析，A260/A280≥1.9，A260/A230≥1.5 被認為純度較好。

1.2.4 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件統(tǒng)計分析，實驗結果以±s表示，以單因素方差分析進行統(tǒng)計學檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 總RNA電泳分析結果

對采用試劑盒Ⅰ的方法提取的總RNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，28S、18S和5S電泳條帶很弱，改良后得到的RNA電泳條帶明顯出現(xiàn)(見圖1);采用試劑盒Ⅱ的方法提取的總RNA電泳后28S、18S和5S條帶較清晰，改良后條帶亮度有明顯增加，28S和18S比值約為2，提示RNA完整性好;采用Trizol試劑法提取的RNA電泳后28S、18S和5S條帶亮度最高，28S和18S比值在1-2之間，但伴有輕微拖尾現(xiàn)象。

圖1 小鼠腦組織總RNA普通瓊脂糖凝膠電泳圖Figure 1 Agarose gel electrophoresis of total RNA from mouse brain

2.2 RNA、cRNA產量和純度測定結果

不同方法提取的總RNA產量和純度見表1。從表1可以看出，Trizol試劑法提取的總RNA產量高于兩種試劑盒提取的總RNA產量，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);試劑盒Ⅰ、Ⅱ經(jīng)改良后，RNA產量均有明顯增加，與改良前相比差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);試劑盒Ⅱ提取的總RNA產量顯著高于試劑盒Ⅰ提取的總RNA產量，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);試劑盒Ⅰ、Ⅱ改良后 A260/A280、A260/A230的比值與改良前相比沒有顯著性差異;試劑盒Ⅱ的A260/A280、A260/A230的比值明顯高于Trizol法和試劑盒Ⅰ，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。

不同方法提取的總RNA均取500 ng進行反轉錄，得到的cRNA濃度見表2。以試劑盒Ⅱ法得到的cRNA濃度最高，與Trizol法和試劑盒Ⅰ相比，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。試劑盒Ⅱ改良前后得到的cRNA濃度無統(tǒng)計學差異。

表1 不同方法提取小鼠腦組織總RNA的產量和純度(±s，n=5)Table 1 RNA yield and purity by different RNA extraction methods(±s，n=5)

表1 不同方法提取小鼠腦組織總RNA的產量和純度(±s，n=5)Table 1 RNA yield and purity by different RNA extraction methods(±s，n=5)

與試劑盒改良前相比，＊P＜0.01;與試劑盒提取法相比，#P＜0.01;與試劑盒Ⅰ相比，▲P＜0.01;與 Trizol法，△P＜0.01

Trizol法 56.58±9.13#1.82±0.74 1.568±0.33

表2 不同方法提取的小鼠腦組織總RNA反轉錄成cRNA的濃度(±s，n=5)Table 2 Concentration of cRNA by total RNA reverse transcription of different RNA extraction methods(±s，n=5)

表2 不同方法提取的小鼠腦組織總RNA反轉錄成cRNA的濃度(±s，n=5)Table 2 Concentration of cRNA by total RNA reverse transcription of different RNA extraction methods(±s，n=5)

與試劑盒Ⅰ相比，*P＜0.01;與 Trizol法相比，#P＜0.01

Trizol法330.20±48.66

3 討論

獲取高質量的RNA是進行基因芯片實驗的必要前提［1-3］?；蛐酒瑢嶒炛饕且苑糯笈c信使RNA(mRNA)完全配對的互補RNA(cRNA)，再進行后續(xù)的芯片雜交實驗。如果RNA存在嚴重的降解，那么許多mRNA并不能被忠實地放大，因此會產生許多偽陰性的結果，芯片結果的可靠性大大降低［6-10］。RNA中蛋白、酚類或胍鹽等物質的殘留，則可能干擾反轉錄反應的過程。

RNA質量控制一般通過樣品吸光值比率和瓊脂糖凝膠電泳進行評估，A260/A280的比值用于估計核酸的純度，是否存在蛋白和苯酚污染;A260/A230比值用于估計脫鹽程度［11-18］?；蛐酒瑢嶒瀸悠返囊鬄?總 RNA濃度≥100 ng/μl，RNA總量≥2 μg，A260/A280≥1.9，A260/A230≥1.5，RNA 電泳 28S 與18S的比值接近2。按以上標準，Trizol法提取的RNA產量最高，A260/A280、A260/A230的比值基本滿足基因芯片實驗要求，但A260/A280、A260/A230的比值低于Ambion試劑盒提取法，且RNA電泳后28S、18S條帶伴有輕微拖尾現(xiàn)象。天根試劑盒和Ambion試劑盒在方法改良后均取得了較理想的提取結果，RNA總量有明顯提高，但天根試劑盒提取的RNA A260/A280，A260/A230比值偏低，這種純度的 RNA可以滿足普通RT-PCR試驗需求，但無法保障基因芯片實驗要求;而Ambion試劑盒提取的RNA A260/A280，A260/A230比值滿足基因芯片實驗要求;說明Ambion試劑盒改良后提取的RNA質量最佳。

基因芯片實驗主要是以放大與mRNA完全配對的cRNA，再進行與芯片的雜交反應，雜交濃度為150 ng/μl。本實驗中，取等量的RNA進行反轉錄得到的cRNA，以Ambion試劑盒提取的cRNA濃度最高，與Trizol法和天根試劑盒相比差異有統(tǒng)計學意義。進一步說明Ambion試劑盒提取的RNA質量優(yōu)于Trizol法和天根試劑盒。

綜上所述，Ambion試劑盒法提取的小鼠腦組織總RNA的產量和純度均能滿足芯片實驗要求。本實驗通過優(yōu)化改良后得到的總RNA產量有顯著提高，而且對RNA的純度和完整性沒有影響。

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