稻草秸稈預(yù)處理方法對綠色木霉產(chǎn)纖維素酶的研究

孫憲迅+孫憲猛+韓雪+孫齊英

摘要：以稻草秸稈為原料，采用不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的磷酸、氨水、磷酸與氨水聯(lián)合浸泡處理等方法對稻草桔稈進(jìn)行預(yù)處理，預(yù)處理后稻草用于纖維素酶固態(tài)發(fā)酵。以羧甲基纖維素酶（CMC）酶活和濾紙酶（FPA）酶活為指標(biāo)，比較不同預(yù)處理方法對綠色木霉（Trichoderma viride）固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的影響。研究結(jié)果表明，磷酸與氨水聯(lián)合預(yù)處理秸稈最有利于綠色木霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶，羧甲基纖維素酶（CMC）酶活和濾紙酶（FPA）酶活分別是未處理的283.25%和174.38%。

關(guān)鍵詞：稻草秸稈；綠色木霉（Trichoderma viride）；固態(tài)發(fā)酵；纖維素酶

中圖分類號(hào)：TS254.9 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2014）18-4387-03

近年來，由于化石能源枯竭和大量使用帶來的溫室效應(yīng)，可再生資源的開發(fā)利用日益受到人們重視[1，2]。稻草是一種非常豐富的可再生能源，利用稻草秸稈生產(chǎn)纖維素酶，對纖維乙醇的生產(chǎn)有重要的現(xiàn)實(shí)意義[3，4]。稻草秸稈主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素組成，其中木質(zhì)素的包覆作用及纖維素結(jié)晶致密結(jié)構(gòu)使各種菌株產(chǎn)酶活力低，成本高。采用物理、化學(xué)和生物方法對稻草進(jìn)行預(yù)處理，盡量除去木質(zhì)素，破壞纖維素的晶體結(jié)構(gòu)，提高纖維素酶的活力[5]。通常的預(yù)處理方法往往以預(yù)處理產(chǎn)糖或者后續(xù)酶解率為考核指標(biāo)，而預(yù)處理方法對微生物利用產(chǎn)酶的研究報(bào)道很少[6-11]。本研究以綠色木霉（Trichoderma viride）為出發(fā)菌株，研究幾種稻草預(yù)處理方法對菌株產(chǎn)纖維素酶效果的影響進(jìn)行了比較。

1 材料與方法

1.1 材料

菌種為綠色木霉，實(shí)驗(yàn)室保藏；稻草秸稈取自武漢漢陽郊區(qū)。

1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基；發(fā)酵培養(yǎng)基[12]：稻草∶麩皮=3∶2，固液比為1∶2，Mandrels溶液與固體比=2∶1；Mandrels營養(yǎng)液：KH2PO4 2 g，（NH4）2SO4 1.4 g，尿素0.3 g，MgSO4 7H2O 0.3 g，CaCl2 0.3 g，F(xiàn)eSO4 7H2O 5 mg，MnSO4 H2O 1.56 mg，ZnSO4 1.4 mg，CoCl2 0.2 mg，水1 L。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 木霉發(fā)酵產(chǎn)酶及測試[13] 在250 mL三角瓶中裝入5%固體培養(yǎng)基（稻草15 g，麩皮10 g，Mandrels溶液50 mL）按2%接入種子液，于37 ℃發(fā)酵72 h，每隔12 h搖勻一次固體培養(yǎng)基，發(fā)酵結(jié)束后，室溫自然風(fēng)干即為纖維素酶干曲。粗酶液的制備：取纖維素酶干曲5 g加200 mL去離子水溶解，紗布過濾后3 000 r/min離心，再適當(dāng)稀釋即為待測酶液。

1.3.2 酶活測定 羧甲基纖維素鈉酶活（CMC）單位定義：在40 ℃ pH 4.8條件下，每l g纖維素酶干曲在1 min內(nèi)水解CMC生成l μmol葡萄糖的酶量，為一個(gè)纖維素酶（CMC酶）活力單位（以U表示）； 濾紙酶活（FPA）單位定義：在40 ℃ pH 4.8條件下，每 l g纖維素酶干曲在l h內(nèi)水解新華濾紙，生成l μmol葡萄糖的酶量，為一個(gè)纖維素酶濾紙酶活單位（以U表示）。

1）羧甲基纖維素鈉酶活（CMC）測定。吸取0.5 mL粗酶稀釋液于試管中，加入1.5 mL 1%CMC-檸檬酸緩沖液（0.1 mol/L，pH 4.8），于40 ℃水浴反應(yīng)30 min，立即加入2.5 mL DNS煮沸滅活，測定還原糖含量。

2）濾紙酶活（FPA）測定。吸取0.5 mL粗酶稀釋液于試管中，加入1.5 mL檸檬酸緩沖液（0.1 mol/L，pH 4.8），混勻后將1條1 cm×6 cm的濾紙條卷成小卷放入其中，于40 ℃水浴反應(yīng)60 min，立即加入2.5 mL DNS煮沸滅活，測定還原糖含量。

1.3.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1）稻草粉碎度對綠色木霉發(fā)酵的影響。稻草先剪成5 cm左右，再用氣流式超微高速粉碎機(jī)粉碎后，分別用100、80、60、40、20目的篩子過篩分級(jí)，各稱取適量稻草粉作為惟一碳源，配置培養(yǎng)基，比較不同粉碎度對綠色木霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的影響。

2）濃磷酸預(yù)處理對綠色木霉發(fā)酵的影響。將稻草秸稈粉碎，過60目篩，按稻草與不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的濃磷酸按固液比（m/V，g∶mL，下同）1∶8在50 ℃處理時(shí)間1.0 h，預(yù)處理結(jié)束后，過濾，濾餅烘干至恒重備用。稱取適量預(yù)處理后稻草粉作為惟一碳源，配置培養(yǎng)基，比較不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)濃磷酸預(yù)處理對綠色木霉產(chǎn)纖維素酶固態(tài)發(fā)酵的影響，以不處理的為對照（CK）。

3）氨水預(yù)處理對綠色木霉發(fā)酵的影響。將稻草秸稈粉碎，過60目篩，稻草與不同濃度氨水按固液比1∶8室溫下預(yù)處理35 h，過濾，濾餅烘干至恒重備用。稱取適量預(yù)處理后稻草粉作為惟一碳源，配置培養(yǎng)基，比較不同濃度氨水預(yù)處理對綠色木霉產(chǎn)纖維素酶固態(tài)發(fā)酵的影響，以不處理的為對照（CK）。

4）氨水與濃磷酸結(jié)合預(yù)處理。①將過60目篩的稻草秸稈粉末，先用15%氨水按固液比1∶6室溫下浸泡20 h，過濾，風(fēng)干；再用40%濃磷酸按1∶10，溫度50 ℃處理時(shí)間30 min，過濾，濾餅烘干至恒重備用；②將過60目篩的稻草秸稈粉末，先用40%濃磷酸按固液比1∶10，溫度50 ℃處理時(shí)間30 min，過濾，風(fēng)干；再用15%氨水按固液比1∶6，室溫下浸泡20 h，過濾，濾餅烘干至恒重備用，后續(xù)酶活測定同氨水處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 稻草粉碎度對綠色木霉產(chǎn)酶的影響

不同粉碎度的稻草粉作為碳源，綠色木霉表現(xiàn)出不同的產(chǎn)纖維素酶能力（表1）。由表1可以看出，稻草秸稈粉碎后的CMC酶活和濾紙酶活比未處理的對照都高，而且隨著粉碎度的增加，產(chǎn)酶能力逐漸提高。從20目升高到60目時(shí)，酶活升高較快。當(dāng)粉碎度達(dá)到60目時(shí)，產(chǎn)酶能力較高。當(dāng)從60目升高到100目時(shí)，產(chǎn)酶增加不多。目數(shù)越大，預(yù)處理成本越大。從節(jié)約成本和能源的角度考慮，以選擇粉碎度60目為宜。

2.2 磷酸預(yù)處理對綠色木霉產(chǎn)酶的影響

以對照組的CMC酶和FPA酶活為100%，計(jì)算采用不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)磷酸預(yù)處理后各組的相對酶活（表2）。磷酸預(yù)處理后的稻草粉過濾烘干直接作為綠色木霉的碳源進(jìn)行纖維素酶發(fā)酵，所產(chǎn)的酶活比未處理的對照都低。磷酸預(yù)處理稻草粉可以裂解木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)，降解部分半纖維素，破壞纖維素的晶體結(jié)構(gòu)。稻草經(jīng)磷酸預(yù)處理產(chǎn)生呋喃、酚醛以及其他有機(jī)酸等物質(zhì)，而其中一些物質(zhì)不但對微生物生長具有抑制作用，而且不利于菌株的產(chǎn)酶。磷酸是不揮發(fā)性酸，殘留的磷酸抑制菌株的生長與產(chǎn)酶。磷酸預(yù)處理后的稻草烘干直接發(fā)酵CMC酶活和FPA酶活明顯降低。

2.3 氨水預(yù)處理對綠色木霉產(chǎn)酶的影響

以對照組的CMC酶和濾紙酶活為100%，計(jì)算采用不同濃度氨水預(yù)浸泡的各組的相對酶活（表3）。氨水預(yù)處理后的稻草粉過濾烘干直接作為綠色木霉的碳源進(jìn)行纖維素酶發(fā)酵，所產(chǎn)的酶活比對照未處理的都低。氨水主要是破壞稻草粉的木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)，降解部分半纖維素。殘留的木質(zhì)素小分子物質(zhì)對纖維素酶活有影響，故所測的纖維素酶活較低。殘余的氨水易揮發(fā)，又能被綠色木霉當(dāng)?shù)醇右岳?，纖維素被氨水浸泡預(yù)處理后直接發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶比磷酸預(yù)處理效果好。

2.4 磷酸氨水聯(lián)合預(yù)處理結(jié)果

稻草粉先用15%氨水浸泡，再用濃磷酸預(yù)處理，過濾、烘干的稻草粉作為綠色木霉的碳源進(jìn)行纖維素酶發(fā)酵，所測的CMC酶活和FPA酶活與對照的比較，都明顯降低，但比單獨(dú)的磷酸處理降低要少。這與氨水浸泡帶走部分木質(zhì)素，后用磷酸處理產(chǎn)生的副產(chǎn)物較少有關(guān)，主要是殘留的磷酸對綠色木霉產(chǎn)酶影響。稻草粉先用磷酸處理，再用氨水浸泡，過濾、烘干的稻草粉作為綠色木霉的碳源進(jìn)行纖維素酶發(fā)酵，所測的CMC酶活和濾紙酶活分別是未處理的283.25%和174.38%。其原因可能是磷酸預(yù)處理破壞大部分木質(zhì)素，纖維素的晶體結(jié)構(gòu)被破壞。在此過程中產(chǎn)生的一些副產(chǎn)物如呋喃、酚醛以及其他有機(jī)酸等，被后續(xù)的氨水稀釋帶走。磷酸處理中殘留的磷酸被氨水中和，被帶走或者生成磷酸鹽被微生物吸收利用。氨水在后處理過程中，對木質(zhì)素也有部分溶解作用，使稻草中的木質(zhì)素處理更加完全。而氨水易揮發(fā)殘留少，即使在稻草中也能被微生物作為氮源吸收利用，所產(chǎn)生的CMC酶活和FPA酶活明顯提高。

3 小結(jié)與討論

粉碎度對綠色木霉利用稻草作為惟一的碳源產(chǎn)纖維素酶有幫助。粉碎度越大，同樣條件下產(chǎn)纖維素酶酶活越高，考慮到生產(chǎn)成本，粉碎到60目就滿足工藝條件。取機(jī)械粉碎后的稻草過60目篩，先用40%的磷酸預(yù)處理，過濾晾干后再用10%的氨水浸泡，預(yù)處理的稻草粉纖維素酶發(fā)酵，所測的CMC酶活和濾紙酶活分別是未處理的283.25%和174.38%。

目前采用酸堿預(yù)處理木質(zhì)纖維素原料是常用的方法，但是原料預(yù)處理后，須用大量的水進(jìn)行洗滌和脫毒處理。既產(chǎn)生大量的廢水，污染環(huán)境，又會(huì)去除部分營養(yǎng)成分，導(dǎo)致必要營養(yǎng)素缺乏，需要在后續(xù)工藝中添加。采用先磷酸處理后氨水浸泡的方法，不需要進(jìn)行洗滌和脫毒處理，微生物能利用生產(chǎn)纖維素酶。本工藝首先利用磷酸部分脫除稻草粉中木質(zhì)素和破壞纖維素的晶體結(jié)構(gòu)，再用氨水浸泡，氨水既中和殘留的磷酸，又部分去除木質(zhì)素，使得微生物能利用纖維素產(chǎn)酶。操作在常溫常壓下進(jìn)行，對設(shè)備要求和節(jié)能方面具有優(yōu)勢，采用本工藝可以降低生產(chǎn)成本和能耗。

參考文獻(xiàn)：

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2.2 磷酸預(yù)處理對綠色木霉產(chǎn)酶的影響

以對照組的CMC酶和FPA酶活為100%，計(jì)算采用不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)磷酸預(yù)處理后各組的相對酶活（表2）。磷酸預(yù)處理后的稻草粉過濾烘干直接作為綠色木霉的碳源進(jìn)行纖維素酶發(fā)酵，所產(chǎn)的酶活比未處理的對照都低。磷酸預(yù)處理稻草粉可以裂解木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)，降解部分半纖維素，破壞纖維素的晶體結(jié)構(gòu)。稻草經(jīng)磷酸預(yù)處理產(chǎn)生呋喃、酚醛以及其他有機(jī)酸等物質(zhì)，而其中一些物質(zhì)不但對微生物生長具有抑制作用，而且不利于菌株的產(chǎn)酶。磷酸是不揮發(fā)性酸，殘留的磷酸抑制菌株的生長與產(chǎn)酶。磷酸預(yù)處理后的稻草烘干直接發(fā)酵CMC酶活和FPA酶活明顯降低。

2.3 氨水預(yù)處理對綠色木霉產(chǎn)酶的影響

以對照組的CMC酶和濾紙酶活為100%，計(jì)算采用不同濃度氨水預(yù)浸泡的各組的相對酶活（表3）。氨水預(yù)處理后的稻草粉過濾烘干直接作為綠色木霉的碳源進(jìn)行纖維素酶發(fā)酵，所產(chǎn)的酶活比對照未處理的都低。氨水主要是破壞稻草粉的木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)，降解部分半纖維素。殘留的木質(zhì)素小分子物質(zhì)對纖維素酶活有影響，故所測的纖維素酶活較低。殘余的氨水易揮發(fā)，又能被綠色木霉當(dāng)?shù)醇右岳?，纖維素被氨水浸泡預(yù)處理后直接發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶比磷酸預(yù)處理效果好。

2.4 磷酸氨水聯(lián)合預(yù)處理結(jié)果

稻草粉先用15%氨水浸泡，再用濃磷酸預(yù)處理，過濾、烘干的稻草粉作為綠色木霉的碳源進(jìn)行纖維素酶發(fā)酵，所測的CMC酶活和FPA酶活與對照的比較，都明顯降低，但比單獨(dú)的磷酸處理降低要少。這與氨水浸泡帶走部分木質(zhì)素，后用磷酸處理產(chǎn)生的副產(chǎn)物較少有關(guān)，主要是殘留的磷酸對綠色木霉產(chǎn)酶影響。稻草粉先用磷酸處理，再用氨水浸泡，過濾、烘干的稻草粉作為綠色木霉的碳源進(jìn)行纖維素酶發(fā)酵，所測的CMC酶活和濾紙酶活分別是未處理的283.25%和174.38%。其原因可能是磷酸預(yù)處理破壞大部分木質(zhì)素，纖維素的晶體結(jié)構(gòu)被破壞。在此過程中產(chǎn)生的一些副產(chǎn)物如呋喃、酚醛以及其他有機(jī)酸等，被后續(xù)的氨水稀釋帶走。磷酸處理中殘留的磷酸被氨水中和，被帶走或者生成磷酸鹽被微生物吸收利用。氨水在后處理過程中，對木質(zhì)素也有部分溶解作用，使稻草中的木質(zhì)素處理更加完全。而氨水易揮發(fā)殘留少，即使在稻草中也能被微生物作為氮源吸收利用，所產(chǎn)生的CMC酶活和FPA酶活明顯提高。

3 小結(jié)與討論

粉碎度對綠色木霉利用稻草作為惟一的碳源產(chǎn)纖維素酶有幫助。粉碎度越大，同樣條件下產(chǎn)纖維素酶酶活越高，考慮到生產(chǎn)成本，粉碎到60目就滿足工藝條件。取機(jī)械粉碎后的稻草過60目篩，先用40%的磷酸預(yù)處理，過濾晾干后再用10%的氨水浸泡，預(yù)處理的稻草粉纖維素酶發(fā)酵，所測的CMC酶活和濾紙酶活分別是未處理的283.25%和174.38%。

目前采用酸堿預(yù)處理木質(zhì)纖維素原料是常用的方法，但是原料預(yù)處理后，須用大量的水進(jìn)行洗滌和脫毒處理。既產(chǎn)生大量的廢水，污染環(huán)境，又會(huì)去除部分營養(yǎng)成分，導(dǎo)致必要營養(yǎng)素缺乏，需要在后續(xù)工藝中添加。采用先磷酸處理后氨水浸泡的方法，不需要進(jìn)行洗滌和脫毒處理，微生物能利用生產(chǎn)纖維素酶。本工藝首先利用磷酸部分脫除稻草粉中木質(zhì)素和破壞纖維素的晶體結(jié)構(gòu)，再用氨水浸泡，氨水既中和殘留的磷酸，又部分去除木質(zhì)素，使得微生物能利用纖維素產(chǎn)酶。操作在常溫常壓下進(jìn)行，對設(shè)備要求和節(jié)能方面具有優(yōu)勢，采用本工藝可以降低生產(chǎn)成本和能耗。

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[12] 邱雁臨，孫憲迅，曾 瑩.發(fā)酵秸稈生產(chǎn)纖維素酶工藝條件的研究[J].糧油食品科技，2004，12（4）：4-6.

[13] 邱雁臨，孫憲迅，蔡 俊，等.纖維素酶耐高溫高產(chǎn)菌株的選育[J].中國釀造，2004（2）：15-19.

2.2 磷酸預(yù)處理對綠色木霉產(chǎn)酶的影響

以對照組的CMC酶和FPA酶活為100%，計(jì)算采用不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)磷酸預(yù)處理后各組的相對酶活（表2）。磷酸預(yù)處理后的稻草粉過濾烘干直接作為綠色木霉的碳源進(jìn)行纖維素酶發(fā)酵，所產(chǎn)的酶活比未處理的對照都低。磷酸預(yù)處理稻草粉可以裂解木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)，降解部分半纖維素，破壞纖維素的晶體結(jié)構(gòu)。稻草經(jīng)磷酸預(yù)處理產(chǎn)生呋喃、酚醛以及其他有機(jī)酸等物質(zhì)，而其中一些物質(zhì)不但對微生物生長具有抑制作用，而且不利于菌株的產(chǎn)酶。磷酸是不揮發(fā)性酸，殘留的磷酸抑制菌株的生長與產(chǎn)酶。磷酸預(yù)處理后的稻草烘干直接發(fā)酵CMC酶活和FPA酶活明顯降低。

2.3 氨水預(yù)處理對綠色木霉產(chǎn)酶的影響

以對照組的CMC酶和濾紙酶活為100%，計(jì)算采用不同濃度氨水預(yù)浸泡的各組的相對酶活（表3）。氨水預(yù)處理后的稻草粉過濾烘干直接作為綠色木霉的碳源進(jìn)行纖維素酶發(fā)酵，所產(chǎn)的酶活比對照未處理的都低。氨水主要是破壞稻草粉的木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)，降解部分半纖維素。殘留的木質(zhì)素小分子物質(zhì)對纖維素酶活有影響，故所測的纖維素酶活較低。殘余的氨水易揮發(fā)，又能被綠色木霉當(dāng)?shù)醇右岳?，纖維素被氨水浸泡預(yù)處理后直接發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶比磷酸預(yù)處理效果好。

2.4 磷酸氨水聯(lián)合預(yù)處理結(jié)果

稻草粉先用15%氨水浸泡，再用濃磷酸預(yù)處理，過濾、烘干的稻草粉作為綠色木霉的碳源進(jìn)行纖維素酶發(fā)酵，所測的CMC酶活和FPA酶活與對照的比較，都明顯降低，但比單獨(dú)的磷酸處理降低要少。這與氨水浸泡帶走部分木質(zhì)素，后用磷酸處理產(chǎn)生的副產(chǎn)物較少有關(guān)，主要是殘留的磷酸對綠色木霉產(chǎn)酶影響。稻草粉先用磷酸處理，再用氨水浸泡，過濾、烘干的稻草粉作為綠色木霉的碳源進(jìn)行纖維素酶發(fā)酵，所測的CMC酶活和濾紙酶活分別是未處理的283.25%和174.38%。其原因可能是磷酸預(yù)處理破壞大部分木質(zhì)素，纖維素的晶體結(jié)構(gòu)被破壞。在此過程中產(chǎn)生的一些副產(chǎn)物如呋喃、酚醛以及其他有機(jī)酸等，被后續(xù)的氨水稀釋帶走。磷酸處理中殘留的磷酸被氨水中和，被帶走或者生成磷酸鹽被微生物吸收利用。氨水在后處理過程中，對木質(zhì)素也有部分溶解作用，使稻草中的木質(zhì)素處理更加完全。而氨水易揮發(fā)殘留少，即使在稻草中也能被微生物作為氮源吸收利用，所產(chǎn)生的CMC酶活和FPA酶活明顯提高。

3 小結(jié)與討論

粉碎度對綠色木霉利用稻草作為惟一的碳源產(chǎn)纖維素酶有幫助。粉碎度越大，同樣條件下產(chǎn)纖維素酶酶活越高，考慮到生產(chǎn)成本，粉碎到60目就滿足工藝條件。取機(jī)械粉碎后的稻草過60目篩，先用40%的磷酸預(yù)處理，過濾晾干后再用10%的氨水浸泡，預(yù)處理的稻草粉纖維素酶發(fā)酵，所測的CMC酶活和濾紙酶活分別是未處理的283.25%和174.38%。

目前采用酸堿預(yù)處理木質(zhì)纖維素原料是常用的方法，但是原料預(yù)處理后，須用大量的水進(jìn)行洗滌和脫毒處理。既產(chǎn)生大量的廢水，污染環(huán)境，又會(huì)去除部分營養(yǎng)成分，導(dǎo)致必要營養(yǎng)素缺乏，需要在后續(xù)工藝中添加。采用先磷酸處理后氨水浸泡的方法，不需要進(jìn)行洗滌和脫毒處理，微生物能利用生產(chǎn)纖維素酶。本工藝首先利用磷酸部分脫除稻草粉中木質(zhì)素和破壞纖維素的晶體結(jié)構(gòu)，再用氨水浸泡，氨水既中和殘留的磷酸，又部分去除木質(zhì)素，使得微生物能利用纖維素產(chǎn)酶。操作在常溫常壓下進(jìn)行，對設(shè)備要求和節(jié)能方面具有優(yōu)勢，采用本工藝可以降低生產(chǎn)成本和能耗。

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