卷柏乙醇提取物對(duì)14種植物病原菌的抑制活性

劉霞+龔永歡+王艷紅+肖巧玉+袁小紅+馬林

摘要：采用牛津杯法及瓊脂打孔法測(cè)定卷柏（Selaginella tamariscina）乙醇提取物對(duì)4種植物病原細(xì)菌[柑橘潰瘍病菌（Xanthomonas carotovora pv.citri）、姜瘟病菌（Ralstonia solanacearum）、水稻白葉枯病菌（Xanthomonas oryzae pv.oryzae）、大白菜軟腐病菌（Erwinia carotovora pv. carotovora）]的抗菌活性。結(jié)果表明，在濃度為1 mg/mL時(shí)，卷柏乙醇提取物對(duì)4種供試細(xì)菌具有較好的抑制活性，抑菌圈直徑13.6～15.3 mm，對(duì)姜瘟病菌和水稻白葉枯病菌的最低抑菌濃度為125 μg/mL。采用生長(zhǎng)速率法測(cè)定提取物對(duì)10種植物病原真菌[香蕉酸腐病菌（Geotrichum candidum Link ex Pers）、蘋果輪紋病菌（Physalospora nasei）、油菜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）、小麥赤霉病菌（Fusarium graminearum）、蘋果腐爛病菌（Valsa mali）、玉米小斑病菌（Helminthosporium maydwas）、葡萄黑痘病菌（Sphaceloma ampelinum）、蘋果斑點(diǎn)落葉病菌（Alternarial ternate f.sp.mali）、棉花枯萎病菌（Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum）、番茄棉腐病菌（Pythium ultimum）]的抑制作用，發(fā)現(xiàn)除對(duì)蘋果輪紋病菌的抑制效果較好外（抑制率為56.3%），對(duì)其余供試菌的抑制率均低于50%。

關(guān)鍵詞：卷柏（Selaginella tamariscina）；提取物；植物病原菌；抑菌活性

中圖分類號(hào)：R 285.5；Q946.887；S482.2+92 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2014）18-4320-04

卷柏（Selaginella tamariscina）為蕨類植物門卷柏科（Selaginellaceae）卷柏屬（Selaginella）植物[1]。卷柏屬植物含有黃酮類化合物、酚類化合物及多糖類物質(zhì)等化學(xué)活性成分[2，3]。已有研究發(fā)現(xiàn)，卷柏具有抗病毒[4]、降糖[5]、抗氧化[6]、抗腫瘤[7]及舒張血管[8]等藥理活性。關(guān)于卷柏提取物及化學(xué)成分的抑菌活性已有報(bào)道，周仁超等[9]研究發(fā)現(xiàn)兗州卷柏（Selaginella involvens Spring）水提物對(duì)變形桿菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、大腸桿菌和痢疾桿菌有一定的抑菌作用。魯曼霞等[2]報(bào)道兗州卷柏穗花杉雙黃酮、β-D-glucopyranoside-（3β）-cholest-5-en-3yl和β-香樹脂醇對(duì)肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和綠膿桿菌具有不同的抑制效果，韓國(guó)學(xué)者Jung等[10]研究了卷柏（Selaginella tamansina）穗花杉雙黃酮對(duì)幾種真菌的抑制效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)對(duì)釀酒酵母菌、黃曲霉、白色念珠菌、白吉利毛孢子菌具有較好的抑制活性。還有研究[11，12]發(fā)現(xiàn)卷柏多糖及炔酚類化合物對(duì)動(dòng)植物病原菌也具有抑制活性。研究卷柏及其有效成分對(duì)植物病原菌的抑制作用的報(bào)道較為少見，陳曉清等[11]報(bào)道卷柏多糖對(duì)甘薯薯瘟病菌、玉米大斑病菌、稻瘟病菌、甘蔗黑穗病菌、爛尾病菌有抑制效應(yīng)。本研究針對(duì)14種常見的農(nóng)作物病原細(xì)菌與真菌，測(cè)定卷柏乙醇提取物對(duì)其的抑制作用，目的在于豐富卷柏的抑菌作用譜，探索其作為植物源殺菌劑的潛力。

1 材料與方法

1.1 卷柏及乙醇提取物

卷柏干燥全草購(gòu)自綿陽本地中藥材公司，經(jīng)綿陽師范學(xué)院羅明華教授鑒定。卷柏樣品粉碎，用95%乙醇80 ℃回流提取3次（料液比10∶1），合并提取液，減壓濃縮后用石油醚脫脂，40 ℃烘干得卷柏乙醇提取物。

1.2 供試菌種

細(xì)菌：柑橘潰瘍病菌（Xanthomonas Campestris pv.citri），姜瘟病菌（Ralstonia solanacearum），水稻白葉枯病菌（Xanthomonas oryzae pv.oryzae），大白菜軟腐病菌（Erwinia carotovora pv. carotovora），由四川大學(xué)農(nóng)藥與作物保護(hù)研究所提供。

真菌：香蕉酸腐病菌（Geotrichum candidum Link ex Pers），蘋果輪紋病菌（Physalospora nasei），油菜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum），小麥赤霉病菌（Fusarium graminearum），蘋果腐爛病菌（Valsa mali），玉米小斑病菌（Helminthosporium maydwas），葡萄黑痘病菌（Sphaceloma ampelinum），蘋果斑點(diǎn)落葉病菌（Alternarial ternate f.sp.mali），棉花枯萎病菌（Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum），番茄棉腐病菌（Pythium ultimum），由西南科技大學(xué)生物科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心保存。

1.3 供試藥液

卷柏乙醇提取物用1% NaOH溶解并配制成濃度為1 mg/mL的母液，將母液按倍數(shù)稀釋法配成濃度為0.5、0.25、0.125、0.062 5 mg/mL的供試液，置于4 ℃冰箱備用。

將青霉素鈉用20%甲醇溶解配成0.5 mg/mL的母液，將母液按倍數(shù)稀釋法配成濃度為0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25 mg/mL的溶液，置于4 ℃冰箱備用。

1.4 菌種活化

1.4.1 細(xì)菌活化采用液體牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基[13] 將冰箱保存的細(xì)菌菌種分別接一環(huán)于20 mL滅菌的液體牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)18～24 h。

1.4.2 真菌活化采用PDA培養(yǎng)基[13] 接種真菌的菌餅（直徑6 mm）于20 mL PDA平板培養(yǎng)基中心，28 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，直至菌絲長(zhǎng)滿整個(gè)培養(yǎng)皿。

1.5 抑制細(xì)菌活性測(cè)定

采用牛津杯法測(cè)定卷柏乙醇提取物對(duì)4種植物病原細(xì)菌的抑制效應(yīng)，參考劉健等[14]的方法并略作改動(dòng)。倒好平板并冷卻，吸取菌懸液0.2 mL置于平板培養(yǎng)基上并涂布均勻。靜置5 min后每板等距放入5個(gè)牛津杯，其中3個(gè)牛津杯加入0.2 mL的提取物母液，其余兩個(gè)分別加入0.2 mL的1% NaOH溶液和0.2 mL 的0.5 mg/mL 青霉素鈉溶液，分別作為陰性對(duì)照和陽性對(duì)照。每菌種重復(fù)3次。于37 ℃培養(yǎng)48 h后測(cè)定抑菌圈大小。

采用打孔法測(cè)定卷柏乙醇提取物對(duì)4種植物病原細(xì)菌的最低抑菌濃度（MIC），參考曾維才等[15]的方法并略作改動(dòng)。吸取1 mL菌懸液于培養(yǎng)皿中，加入24 mL 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（45～50 ℃），使菌液與培養(yǎng)基充分混勻，靜置冷卻。用直徑6 mm打孔器打孔，分別加入提取物的不同濃度供試液100 μL。于37 ℃培養(yǎng)48 h后觀察抑菌情況，以抑菌圈直徑為7 mm及以上的供試液濃度作為最低抑菌濃度。青霉素鈉陽性對(duì)照采用同樣方法測(cè)定其MIC。

1.6 抑制真菌活性測(cè)定

采用生長(zhǎng)速率法[16]測(cè)定卷柏的乙醇提取物對(duì)10種植物病原真菌的抑制作用。吸取1 mL濃度為1 mg/mL的提取液于培養(yǎng)皿中，加入24 mL PDA培養(yǎng)基（45～50 ℃），充分混勻，靜置冷卻。接種活化的真菌菌餅（直徑6 mm）于培養(yǎng)皿中心?？瞻讓?duì)照接種同樣的菌餅，但不加待測(cè)液。每一菌種及空白對(duì)照均設(shè)3次重復(fù)。于28 ℃恒溫培養(yǎng)3～8 d，每24 h觀察1次，待空白對(duì)照的菌絲長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿時(shí)，用十字交叉法測(cè)量各菌落生長(zhǎng)直徑，計(jì)算抑制率。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)采用DPS 7.05數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，差異顯著性分析采用最小顯著差異法（LSD法）。

2 結(jié)果與分析

2.1 卷柏乙醇提取物對(duì)4種植物病原細(xì)菌的抑制作用

采用牛津杯法測(cè)定卷柏的乙醇提取物對(duì)4種病原細(xì)菌的抑制活性，結(jié)果見表1。在供試濃度為1 mg/mL時(shí)，乙醇提取物對(duì)姜瘟病菌、柑橘潰瘍病菌、大白菜軟腐病菌的抑菌圈直徑均超過15 mm，而對(duì)水稻白葉枯病菌的抑菌圈為13.6 mm，統(tǒng)計(jì)分析表明4個(gè)菌種間均差異不顯著（p<0.05）。

最低抑菌濃度測(cè)定結(jié)果（表2）表明，乙醇提取物對(duì)姜瘟病菌和水稻白葉枯病菌的MIC均為125 μg/mL，而對(duì)大白菜軟腐病菌和柑橘潰瘍病菌的MIC均為250 μg/mL。青霉素鈉陽性對(duì)照的MIC明顯低于卷柏提取物，對(duì)姜瘟病菌、水稻白葉枯病菌、大白菜軟腐病菌的MIC均為12.5 μg/mL，對(duì)柑橘潰瘍病的MIC均為25 μg/mL。

2.2 卷柏乙醇提取物對(duì)植物病原真菌的抑制作用

采用生長(zhǎng)速率法測(cè)定卷柏乙醇提取物對(duì)10種植物病原真菌的抑制作用，結(jié)果（表3）表明，在濃度為1 mg/mL時(shí)，乙醇提取物對(duì)所有供試真菌的抑制作用均較弱，抑制率最高的僅56.3%（蘋果輪紋病菌），對(duì)其余9種真菌的抑制率均低于50%。

3 小結(jié)與討論

研究發(fā)現(xiàn)卷柏乙醇提取物對(duì)柑橘潰瘍病菌、姜瘟病菌、水稻白葉枯病菌和大白菜軟腐病菌具有較好的抑制作用（抑菌圈直徑為13.6～15.3 mm），與陳曉清等[11]采用濾紙片法測(cè)定卷柏多糖抑制甘薯薯瘟病菌的結(jié)果相似（抑菌圈直徑為14.8 mm），而周仁超等[9]采用濾紙片法測(cè)定，發(fā)現(xiàn)兗州卷柏水提物對(duì)變形桿菌、 金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、大腸桿菌、痢疾桿菌的抑制作用在不同菌種間差異較大（抑菌圈直徑為9～28 mm）。根據(jù)NCCLS推薦標(biāo)準(zhǔn)[17]，4種供試細(xì)菌對(duì)卷柏乙醇提取物的敏感性為中敏至高敏。

從最低抑菌濃度測(cè)定結(jié)果看，卷柏乙醇提取物對(duì)4種供試細(xì)菌的MIC為125～250 μg/mL，而從兗州卷柏中分離的穗花杉雙黃酮和β-香樹脂醇對(duì)肺炎鏈球菌以及β-D-glucopyranoside-（3β）-cholest-5-en-3yl對(duì)金黃色葡萄球菌則具有極好的抑制作用（MIC為16 μg/mL）[2]。Cao等[12]的研究也發(fā)現(xiàn)卷柏中3個(gè)新型炔酚類化合物對(duì)金黃色葡萄球菌有很強(qiáng)抑制活性（MIC低于10 μg/mL）。這表明從卷柏乙醇提取物中可以進(jìn)一步分離獲得具有很好抑制植物病原細(xì)菌的活性物質(zhì)。

卷柏中的黃酮類、酚類化合物及多糖物質(zhì)可能對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)起到抑制作用，其作用機(jī)制可能是抑制細(xì)菌核酸合成、影響細(xì)菌細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)與透性或抑制細(xì)胞能量代謝[18，19]。

本研究結(jié)果表明，卷柏乙醇提取物對(duì)植物病原真菌的抑制效果較弱，抑制率最高僅為56.3%，這可能與提取物中抑菌有效成分含量較低有關(guān)。若對(duì)乙醇提取物進(jìn)一步分離純化，提高其有效成分含量，或分離獲得穗花杉雙黃酮等活性物質(zhì)，可能會(huì)有更好的抑制真菌效果。研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)卷柏穗花杉雙黃酮對(duì)釀酒酵母菌、白色念珠菌具有很強(qiáng)的抑制作用（MIC為5 μg/mL）[10]，卷柏多糖對(duì)甘薯薯瘟病菌、綠色木霉和腸炎病菌也具有較好的抑制活性（MIC為6.25 mg/mL）[11]。這說明卷柏中存在對(duì)部分真菌具有很好抑制效果的活性物質(zhì)，因此后續(xù)研究可對(duì)卷柏乙醇提取物進(jìn)行分離純化，進(jìn)一步研究其對(duì)供試真菌的抑制效果或擴(kuò)大抑菌作用篩選范圍，以確定卷柏抑制植物病原真菌的潛力。

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