慢性阻塞性肺疾病患者肺組織和血清HMGB1的表達(dá)及與TNF-α和IL-1β的相關(guān)性

侯 嘉 馬偉榮 劉 潔 段 喻 鄭西衛(wèi)

(寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院呼吸內(nèi)科，寧夏 銀川 750004)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一種氣道慢性炎癥性疾病，其發(fā)病同多種炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及相關(guān)因子作用密切相關(guān)，早期研究集中于白細(xì)胞介素(IL)-4、IL-6、干擾素(IFN)-γ等因子，最新報(bào)道證實(shí)高遷移率族蛋白1(HMGB1)可促進(jìn)多種晚期炎癥因子釋放，在炎癥反應(yīng)中扮演著重要作用〔1〕。本研究通過(guò)檢測(cè)COPD患者肺組織及血清中的HMGB1及腫瘤壞死因子(TNF)-α、IL-1β的表達(dá)，分析前者同后兩者的相關(guān)性，探討其在COPD炎性反應(yīng)過(guò)程中的作用。

1 資料和方法

1.1一般資料 選擇我院2012年4月至2013年4月收治的COPD伴肺癌患者24例作為觀察組，其中男14例，女10例，平均年齡(64.3±6.7)歲;選擇同期住院的無(wú)COPD的肺癌患者24例作為對(duì)照組，其中男13例，女11例，平均年齡(62.1±6.4)歲。COPD診斷標(biāo)準(zhǔn)、嚴(yán)重程度分級(jí)、穩(wěn)定期和急性加重期的定義均參考慢性阻塞性肺疾病診療規(guī)范(2011年版)。兩組患者性別、年齡比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，具有可比性。其次，選擇我科收治的診斷為COPD急性加重期患者156例，其中男114例，女42例，平均年齡(65.3±9)歲，包括輕中度84例，重度72例;呼吸衰竭80例，無(wú)呼吸衰竭76例;行胸部CT診斷有多發(fā)肺大泡58例，無(wú)肺大泡98例。穩(wěn)定期COPD患者80例，其中男74例，女6例，平均年齡(57.4±10)歲。選擇同期體檢證實(shí)無(wú)肺功能異常的健康人80例為正常組，其中男62例，女18 例，平均年齡(58.2±9)歲。

1.2試劑及儀器 使用兔抗人HMGB1單克隆抗體，二抗即用型免疫組化Elivison plus光譜試劑盒，RNA純化試劑盒，高容量逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒，酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒，試劑盒均由由Mabtech公司提供。

1.3實(shí)驗(yàn)方法 規(guī)定實(shí)驗(yàn)選用的肺組織距離肺癌病灶＞5 cm，均分為兩份，一份立即液氮速凍-70℃冰箱保存，一份常規(guī)固定后，行石蠟包埋切片予免疫組化染色。

1.3.1HMGB1表達(dá)的檢測(cè) 采用Elivison二步法檢測(cè)，以已知陽(yáng)性非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)組織為陽(yáng)性對(duì)照，以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗為陰性對(duì)照，分析表達(dá)強(qiáng)度時(shí)，于每個(gè)切片內(nèi)收集5個(gè)高倍視野HMGB1陽(yáng)性染色的平均積分光密度值，分析及記錄過(guò)程用美國(guó)Media Cybernetics Incl公司的Image-Pro Plus圖像分析系統(tǒng)操作。

1.3.2基因表達(dá)的檢測(cè) 將50～150 mg的肺組織于1 ml Trizol中勻漿，根據(jù)試劑盒要求對(duì)總RNA提取并純化。采用TU-1810紫外可見分光光度計(jì)檢測(cè)純化后的RNA濃度及純度，之后用高容量逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒對(duì)其進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，并采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增引物，反應(yīng)條件根據(jù)試劑盒說(shuō)明進(jìn)行，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)對(duì)各基因表達(dá)進(jìn)行歸一化處理。

1.3.3血清HMGB1、TNF-α、IL-1β 測(cè)定 空腹抽靜脈血5 ml，在4℃下離心15 min后，將血清分離并置－70℃保存，每次檢測(cè)前應(yīng)復(fù)蘇至室溫。按照ELISA法說(shuō)明書要求對(duì)HMGB1、TNF-α、IL-1β測(cè)定，試劑盒均由由Mabtech公司提供。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用s表示，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析，相關(guān)性分析采用直線回歸方程。

2 結(jié)果

2.1肺組織中HMGB1蛋白及其mRNA表達(dá) 觀察組24例標(biāo)本中22例陽(yáng)性，陽(yáng)性率87.5%，對(duì)照組24例標(biāo)本中10例染色陽(yáng)性，陽(yáng)性率41.6%(χ2=11.02，P＜0.01)。對(duì)照組 HMGB1 蛋白的平均光密度值為 21.9±9.7，顯著低于觀察組的 46.2±11.5(t=7.91，P＜0.05)。對(duì)照組 HMGB1 的 mRNA 轉(zhuǎn)錄水平為205±58，顯著低于觀察組的 205±58，611±88(t=14.68，P＜0.01)。

2.2血清HMGB1、TNF-α、IL-1β水平比較 COPD急性加重期和COPD穩(wěn)定期患者血清HMGB1、TNF-α、IL-1β水平相比對(duì)照組明顯較高，且COPD急性加重期患者相比穩(wěn)定期患者明顯較高。重度COPD、肺部多發(fā)肺大泡患者血清HMGB1、TNF-α、IL-1β水平相比輕中度、肺部無(wú)肺大泡患者明顯較高。無(wú)呼吸衰竭患者的HMGB1明顯低于有呼吸衰竭患者，差異顯著(t=2.122，P＜0.05)，而呼吸是否衰竭在 TNF-α、IL-1β 水平上無(wú)差異。見表1。

2.3相關(guān)性分析 對(duì)COPD急性加重期患者血清HMGB1與TNF-α、IL-1β水平進(jìn)行相關(guān)性分析表明，兩者存在顯著相關(guān)(r=0.602、0.738，均 P＜0.01)。

表1 血清HMGB1、TNF-α、IL-1β水平比較(s)

表1 血清HMGB1、TNF-α、IL-1β水平比較(s)

組別 n HMGB1(μg/L)TNF-α(ng/L)IL-1β(ng/L)80 1.9±1.0 39.2±15.7 14.2±10.6 COPD 穩(wěn)定期 80 3.1±2.4 72.5±35.9 24.7±15.6 COPD 急性加重期 80 4.8±2.8 101.4±47.8 23.7±18.4 F/P 值 11.842/＜0.05 20.461/＜0.01 6.364/＜0.05輕中度 84 3.6±2.1 89.2±40.5 27.2±16.9重度 72 5.8±3.4 115.6±52.1 39.5±17.1 t/P 值 4.934/0.000 3.557/0.000 4.507/0.000無(wú)肺大泡 98 3.8±2.2 92.1±45.9 30.1±17.7多發(fā)肺大泡 58 6.8±3.1 123.6±48.8 43.9±18.1 t/P 值 7.045/0.000 4.046/0.000 4.667/0.000無(wú)呼吸衰竭 76 4.2±1.9 92.6±46.5 28.5±12.9有呼吸衰竭 80 5.1±3.2 105.3±45.3 31.9±17.2 t/P值正常組2.122/0.035 0.253/0.800 1.391/0.166

3 討論

HMGB1是具有多種核外生物學(xué)功能的非組蛋白，其可高水平表達(dá)于急性肺損傷、過(guò)敏性肺炎等肺部疾病中，有研究認(rèn)為該物質(zhì)具有廣泛促炎性細(xì)胞因子樣作用，通過(guò)介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，參與了肺部疾病的病理過(guò)程。如有研究通過(guò)對(duì)COPD患者支氣管上皮細(xì)胞與肺泡灌洗液進(jìn)行檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，HMGB1表達(dá)明顯高于無(wú)COPD患者及正常對(duì)照〔2～4〕。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究亦證實(shí)HMGB1可高表達(dá)于COPD組大鼠支氣管上皮，且其同氣道、肺血管結(jié)構(gòu)的病理變化相一致〔5～8〕。

本研究結(jié)果提示HMGB1或許參與到了COPD的氣道炎性反應(yīng)過(guò)程中。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，COPD急性加重期患者血清中的HMGB1水平相比COPD穩(wěn)定期患者較高，重度COPD與肺部多發(fā)肺大泡患者相比輕中度與無(wú)肺大泡患者較高，無(wú)呼吸衰竭患者的HMGB1明顯低于有呼吸衰竭患者，可推斷血清HMGB1水平或許可反映COPD炎性反應(yīng)與病理改變的嚴(yán)重程度，同既往研究結(jié)果類似〔9〕。本研究結(jié)果表明HMGB1與血清TNF-α、IL-1β水平在炎性反應(yīng)中存在相互關(guān)聯(lián)。有研究發(fā)現(xiàn)HMGB1或許可通過(guò)IL-1β及晚期糖基化終末產(chǎn)物受體參與到了COPD氣道炎癥反應(yīng)及與組織重構(gòu)中〔10〕。HMGB1同其受體結(jié)合后，通過(guò)活化核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)，將包括 IL-1β、TNF-α在內(nèi)的炎性因子大量釋放，促進(jìn)炎性反應(yīng)，并通過(guò)正反饋進(jìn)一步增加 HMGB1 的分泌，擴(kuò)大炎性反應(yīng)范圍〔11，12〕。

綜上所述，通過(guò)研究可以認(rèn)為，在COPD病程中，HMGB1于肺組織和血清中高度表達(dá)，并同TNF-α和IL-1β等多種炎性介質(zhì)相互作用，擴(kuò)大炎癥反應(yīng)，促進(jìn)疾病進(jìn)展。今后在臨床診療中，可考慮將HMGB1作為治療靶點(diǎn)，或許可在控制疾病急性及慢性進(jìn)展中起到有利作用。

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