食管鱗癌組織中抑癌基因Crnn的表達(dá)及其臨床意義

別亞男，喬俊靜，王 瑾，張 昭，秦艷茹

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科 河南鄭州 450052)

食管鱗癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)是最常見的消化道惡性腫瘤之一，而且位列惡性腫瘤致死率的第6位［1］。食管癌主要有兩種類型，這兩種有不同的病原學(xué)及病理學(xué)特征，ESCC是食管癌的主要組織學(xué)亞型，在不同國家及國家內(nèi)不同地區(qū)有著明顯的地域分布。雖然經(jīng)過多科治療，但是它的預(yù)后仍然比較差，而且5年生存率低于15%［2］。它的發(fā)生、發(fā)展是與遺傳因素、環(huán)境因素等多因素、多步驟相關(guān)的過程，在這個(gè)過程中可能涉及到多個(gè)癌基因的激活和抑癌基因的失活。迄今為止，導(dǎo)致ESCC的分子和細(xì)胞機(jī)制仍未完全明確。

Crnn蛋白是S100蛋白中的一員，在N端有一鈣結(jié)合位點(diǎn)［3］。另一項(xiàng)研究表明，Crnn基因是融合基因中的一員，可能在表皮分化中起到重要的作用［4］。雖然Crnn基因在ESCC中表達(dá)下調(diào)，很可能在正常組織向腫瘤組織轉(zhuǎn)變中丟失［5］，但Crnn蛋白表達(dá)情況及其與臨床病理特征和5年生存率之間的關(guān)系卻沒有相關(guān)研究。為此我們采用免疫組化方法檢測(cè)了Crnn蛋白在食管癌患者組織中的表達(dá)水平，進(jìn)一步了解ESCC的發(fā)生、發(fā)展及影響預(yù)后的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 研究材料 100例食管癌組織及相應(yīng)的癌旁正常黏膜組織(距離腫塊組織5 cm以上)均來自河南省林州市人民醫(yī)院(2002年1月至2005年1月)，其中男46例，女33例;年齡＜59歲43例，≥59歲36例;高分化12例，中分化50例，低分化17例;TNM分期(2002年AJCC分期)Ⅰ期11例，Ⅱ期52例，Ⅲ期10例，Ⅳ期6例;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移21例?；颊咝g(shù)前均未接受任何放療或化療，所有標(biāo)本經(jīng)組織病理學(xué)檢查證實(shí)為原發(fā)性食管鱗狀細(xì)胞癌。

1.2 組織芯片制作 收集常規(guī)病理切片和HE染色，然后在病理切片上根據(jù)形態(tài)學(xué)特點(diǎn)確定好具有代表性的腫瘤部位，用組織陣列儀支架上的X、Y軸刻度尺定位后，用穿刺取樣針在供體蠟塊相應(yīng)的位置進(jìn)行穿刺取樣。預(yù)先制備1個(gè)45×20×20 mm3大小的受體蠟塊，用組織陣列儀(廣州浩翰儀器有限公司生產(chǎn))穿刺取樣針打出間距為1.8 mm，直徑為1 mm，深度為3～4 mm的孔。然后，將用組織陣列儀穿刺所得的微小圓柱形組織擠壓到受體蠟塊上已制備好的陣列孔中。

1.3 免疫組織化學(xué)法 將使用標(biāo)準(zhǔn)的生物素-親和素-過氧化物酶復(fù)合物方法對(duì)免疫組化染色進(jìn)行操作。簡(jiǎn)單來說，石蠟切片脫蠟，加入10%的山羊血清10 min，非特異性結(jié)合被阻斷。然后加入抗Crnn多克隆抗體孵育(1∶100稀釋，4℃過夜;英國劍橋Abcam公司)。之后在辣根過氧化物酶結(jié)合的山羊抗兔免疫球蛋白中孵育(1∶100稀釋，37℃ 30 min)。細(xì)胞質(zhì)中Crnn的表達(dá)分為3個(gè)獨(dú)立的等級(jí)，因?yàn)闆]有發(fā)現(xiàn)有明顯的細(xì)胞著色百分比的差別，因此免疫反應(yīng)性只用染色強(qiáng)度表示(0=未被染色;1=弱染色;2=強(qiáng)染色)。共有79例正常組織及食管鱗癌組織均有效表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)分析應(yīng)用χ2檢驗(yàn)、Fisher精確概率法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組Crnn蛋白表達(dá)情況 ESCC組織中Crnn蛋白表達(dá)陽性率為45.6%(36/79)，食管正常黏膜組織中Crnn蛋白表達(dá)陽性率為93.7%(74/79)，兩組間表達(dá)比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表1和圖1。

表1 兩組Crnn蛋白表達(dá)情況(n，%)

圖1 Crnn蛋白表達(dá)情況評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)(SP染色×400)

2.2 Crnn表達(dá)與ESCC臨床病理特征的關(guān)系 Crnn基因在ESCC中的表達(dá)下調(diào)與不同的年齡組、性別組、腫瘤細(xì)胞分化程度和大體分型可能無關(guān)(P＞0.05)。Crnn與TMN分期相關(guān)(P=0.035)，隨著分期增加，Crnn表達(dá)下調(diào)率逐漸增加，0期～ⅡA期(45.8%)，ⅡB期～ⅣB期(75%);Crnn基因的表達(dá)下調(diào)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移表達(dá)下調(diào)率76.2%，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移表達(dá)下調(diào)率44.8%，兩組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.021)，見表2。

表2 Crnn表達(dá)缺失與ESCC患者臨床病理特征的關(guān)系［n，(%)］

2.3 Crnn表達(dá)與ESCC患者的5年生存率的關(guān)系 Crnn基因表達(dá)下調(diào)ESCC患者的5年生存率明顯低于Crnn基因正常表達(dá)的ESCC患者(P=0.021)，見圖2。

圖2 Crnn表達(dá)與ESCC患者的5年生存率的關(guān)系

3 討論

Crnn基因位于染色體1q21，該基因包含3個(gè)外顯子，編碼一個(gè)含有495個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，N端包含一個(gè)鈣結(jié)合位點(diǎn)，屬于S100家族蛋白［6］。S100家族蛋白的功能相當(dāng)復(fù)雜，而且它們?cè)谀[瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演重要的角色［7］。一項(xiàng)研究表明，Crnn蛋白能夠通過上調(diào)兩種蛋白質(zhì)的表達(dá)來抑制細(xì)胞周期中G1/S轉(zhuǎn)變［8-9］，從而抑制細(xì)胞生長(zhǎng)、促進(jìn)細(xì)胞凋亡和衰老，該蛋白的表達(dá)下調(diào)或缺失可能導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。

通過此次研究發(fā)現(xiàn)，食管正常黏膜組織中Crnn蛋白表達(dá)陽性率為93.7%，而食管鱗癌組織中存在高頻率的表達(dá)下調(diào)(表達(dá)下調(diào)率為53.2%);食管鱗癌中Crnn基因表達(dá)率與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM臨床分期有關(guān)(P均＜0.05)，與正常組織相比，Crnn基因表達(dá)改變可能與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否有關(guān)，這一結(jié)果說明Crnn基因表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象進(jìn)而影響預(yù)后;ⅡB期及更晚分期的ESCC患者腫瘤細(xì)胞的表達(dá)下調(diào)率高于早期，說明ESCC晚期病例Crnn基因表達(dá)下調(diào)更為顯著，該基因可能參與了食管鱗癌的發(fā)展過程，并且隨著腫瘤的進(jìn)展，Crnn的表達(dá)下調(diào)增加。目前關(guān)于Crnn基因表達(dá)下調(diào)可導(dǎo)致ESCC的發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制還不是十分清楚，有研究表明可能通過以下機(jī)制發(fā)揮作用:Crnn基因通過上調(diào)P21WAF1/CIP1和Rb這兩種蛋白質(zhì)的表達(dá)來抑制細(xì)胞周期中G1期向S期轉(zhuǎn)變。G1/S期轉(zhuǎn)變是細(xì)胞周期循環(huán)進(jìn)展的一個(gè)重要關(guān)卡，而P21WAF1/CIP1是這一轉(zhuǎn)變期間具有決定性的負(fù)性調(diào)控因子之一。Rb是另一腫瘤形成過程中重要的抑制基因，當(dāng)rb基因突變或丟失時(shí)，E2f轉(zhuǎn)錄因子會(huì)被釋放然后導(dǎo)致促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的基因的過度表達(dá)［10-11］。因此當(dāng)Crnn基因表達(dá)下調(diào)或缺失時(shí)，會(huì)使抑制細(xì)胞增殖的兩種蛋白質(zhì)表達(dá)下降，從而導(dǎo)致細(xì)胞過度分裂。通過上面的機(jī)制表明，Crnn基因?qū)?xì)胞增殖起負(fù)性調(diào)節(jié)作用。

本研究發(fā)現(xiàn)Crnn基因表達(dá)下調(diào)的ESCC患者的5年生存率明顯低于Crnn基因正常表達(dá)的食管鱗癌患者，說明Crnn表達(dá)下調(diào)的腫瘤比Crnn正常表達(dá)的腫瘤更具有侵襲性和轉(zhuǎn)移性，Crnn蛋白表達(dá)下調(diào)對(duì)惡性腫瘤細(xì)胞侵襲作用的抑制性減弱，使腫瘤侵蝕及轉(zhuǎn)移進(jìn)而影響患者的生存時(shí)間，Crnn可能作為影響患者生存時(shí)間的一個(gè)獨(dú)立因素;Crnn基因在ESCC中的表達(dá)下調(diào)與不同的年齡階段、性別、腫瘤細(xì)胞分化高低和大體分型可能無關(guān)(P均＞0.05)。

近段時(shí)間研究表明，在很多實(shí)體腫瘤中都能檢測(cè)到在lq21染色體位點(diǎn)上雜合性的丟失(LOH)，包括食管鱗狀細(xì)胞癌［12］、肺癌［13］、胰島素瘤［14］和食管上皮腺癌［15］。更有意思的是，lq21位點(diǎn)雜合性的丟失和腫瘤的惡性度［14］及生存時(shí)間縮短有關(guān)［15］。由此我們可以推測(cè)，Crnn基因位點(diǎn)處雜合性的丟失導(dǎo)致了ESCC的發(fā)生、發(fā)展。

綜上所述，Crnn基因的表達(dá)下調(diào)參與了食管鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展與預(yù)后，Crnn基因表達(dá)的下調(diào)可能與食管鱗癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期及生存時(shí)間有關(guān)，Crnn基因表達(dá)下調(diào)與否的檢測(cè)對(duì)食管鱗癌的臨床診斷可能具有一定的價(jià)值，同時(shí)可以為判斷患者預(yù)后提供參考。

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