磷酸化高分子量神經(jīng)微絲蛋白在脊髓損傷評(píng)定中的研究進(jìn)展

何件根 武 亮

北京小湯山醫(yī)院康復(fù)中心，北京 102211

脊髓損傷導(dǎo)致的感覺和運(yùn)動(dòng)功能的缺失，不僅是由原發(fā)性損傷引起，同時(shí)各種原因引起的繼發(fā)性損傷也會(huì)導(dǎo)致脊髓神經(jīng)功能的進(jìn)一步缺失，這其中包括炎性反應(yīng)、缺氧及毒素等導(dǎo)致的遲發(fā)型神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡、軸突退化等[1-2]?？茖W(xué)家及醫(yī)務(wù)工作者們一致認(rèn)為應(yīng)該在脊髓損傷的早期而不是慢性期進(jìn)行治療干預(yù)[3-4]，他們致力于尋找更多有效的方法來(lái)防止繼發(fā)性損傷導(dǎo)致的神經(jīng)組織損傷、神經(jīng)組織及其功能重建，因此，在脊髓損傷的早期很多藥物及組織工程方法被應(yīng)用于治療干預(yù)[5]。 但是，在研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)脊髓損傷早期的治療效果很難評(píng)價(jià)，主要是因?yàn)榧顾栊菘似诘拇嬖赱5-6]，脊髓損傷的基礎(chǔ)損傷嚴(yán)重程度很難評(píng)價(jià)。

1 傳統(tǒng)的脊髓損傷評(píng)價(jià)方法

目前脊髓損傷的評(píng)價(jià)方法主要有神經(jīng)功能學(xué)評(píng)價(jià)、影像學(xué)評(píng)價(jià)、神經(jīng)電生理檢查、組織形態(tài)學(xué)觀察等[7-9]。 目前在臨床中應(yīng)用的神經(jīng)功能學(xué)評(píng)價(jià)方法主要為ASIA 評(píng)價(jià)方法[10]，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用的主要為BBB 評(píng)分，但在脊髓損傷休克期神經(jīng)功能檢查結(jié)果并不能真實(shí)反映脊髓的神經(jīng)功能狀況[11-12]。 對(duì)于認(rèn)知功能有問(wèn)題及不能很好配合檢查的兒童也不能完成神經(jīng)功能檢查。 脊髓損傷后影像學(xué)檢查主要包括X 線、CT、MRI，X 線和CT 并不能清晰反映脊髓等軟組織的結(jié)構(gòu)狀況，主要是用于評(píng)價(jià)骨性結(jié)構(gòu)的連續(xù)性及完整性，MRI 被認(rèn)為是脊髓損傷診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但在超急性期MRI 不能良好地顯示脊髓的損傷狀況，早期患者不宜于大幅度移動(dòng)也限制了MRI 在脊髓損傷中的實(shí)時(shí)追蹤，而且對(duì)于一些體內(nèi)存在磁性金屬物質(zhì)如槍傷的患者不適于行MRI 檢查[13-14]。 神經(jīng)電生理檢查主要包括體感誘發(fā)電位（SEP）、動(dòng)作誘發(fā)電位（MEP）、肌電圖（EMG）[15]，此方法操作較簡(jiǎn)單，但是干擾因素太多，且MEP 在脊髓損傷休克期也不能做出評(píng)估，也無(wú)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[9]。 組織形態(tài)學(xué)[16]廣泛應(yīng)用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，但臨床中無(wú)法應(yīng)用。 還有一些不常用的評(píng)定方法，如脊髓血流量測(cè)定法[17]、神經(jīng)束路示蹤法[18]等，目前只是偶爾用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。

2 分子標(biāo)志物在脊髓損傷領(lǐng)域研究的狀況

基于在脊髓損傷休克期傳統(tǒng)方法不能完全評(píng)價(jià)脊髓損傷狀況，研究者開始考慮是不是可以在微觀水平尋找一項(xiàng)指標(biāo)來(lái)評(píng)價(jià)脊髓損傷休克期的脊髓原發(fā)性及繼發(fā)性損傷嚴(yán)重程度，因此，分子標(biāo)志物的研究逐漸受到重視。 目前研究的分子標(biāo)志物主要有小分子量的鈣結(jié)合蛋白S100、神經(jīng)元特異性烯醇酶（NSE）及神經(jīng)微絲蛋白（NF）。 有研究顯示S100 及NSE 不僅存在于神經(jīng)細(xì)胞中，在其他非神經(jīng)細(xì)胞也檢測(cè)到他們的存在[19]。大量研究發(fā)現(xiàn)，血清中S100 及NSE在脊髓損傷后6 h 達(dá)高峰，24 h 降至基線水平，這是因?yàn)镾100 及NSE 穩(wěn)定性較差，容易被蛋白酶水解[20-22]。而NF 只存在于神經(jīng)細(xì)胞當(dāng)中，神經(jīng)細(xì)胞特異性強(qiáng)，并且有很強(qiáng)的抗酶解能力，特別是磷酸化的神經(jīng)微絲蛋白（pNF）抗酶解能力更強(qiáng)。 NF 存在3 種亞結(jié)構(gòu)，分別為低分子量的神經(jīng)微絲蛋白（NF-L）、中分子量的神經(jīng)微絲蛋白（NF-M）以及高分子量的神經(jīng)微絲蛋白（NF-H），在神經(jīng)細(xì)胞的分子標(biāo)志物當(dāng)中NF-H 含量最高，NF-L、NF-M 及其他分子標(biāo)志物含量均較低[23]，因此磷酸化的高分子量神經(jīng)微絲蛋白（pNF-H）無(wú)疑是評(píng)價(jià)脊髓損傷很有前景的一項(xiàng)指標(biāo)。

3 pNF-H 的研究

早在20 世紀(jì)80 年代，Lee 等[24]就曾做過(guò)NF 的蛋白序列研究，發(fā)現(xiàn)NF 蛋白中存在許多賴氨酸-絲氨酸-脯氨酸多肽重復(fù)序列，且為磷酸化的活性狀態(tài)，這種結(jié)構(gòu)使得NF具有很強(qiáng)的抗鈣蛋白及其他水解酶的能力。

3.1 pNF-H 在脊髓損傷動(dòng)物模型的首次研究

由于pNF-H 具有中樞神經(jīng)細(xì)胞特異性強(qiáng)、含量高、穩(wěn)定性強(qiáng)、標(biāo)本采集方便等特性，有學(xué)者就假設(shè)是否可以通過(guò)某種方法測(cè)定血清當(dāng)中的pNF-H 含量來(lái)評(píng)估神經(jīng)細(xì)胞退化及凋亡情況從而評(píng)估脊髓損傷的嚴(yán)重程度及脊髓損傷的進(jìn)展過(guò)程。 2005 年Shaw 等[25]為驗(yàn)證這一假設(shè)設(shè)計(jì)了一項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，對(duì)照組單純行T11椎板切除，實(shí)驗(yàn)組1 采用NYU 打擊器10 g 的滑棒在25 mm 高度下造成大鼠T11脊髓挫傷模型，實(shí)驗(yàn)組2 采用手術(shù)刀造成大鼠脊髓T11半切的橫斷性損傷，分別在術(shù)前、術(shù)后1 h、2 h、4 h、6 h、12 h、16 h、24 h、2 d、3 d、4 d、5 d、7 d、14 d 采集血樣，采用ELISA 方法進(jìn)行測(cè)定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在術(shù)前及對(duì)照組的血清中未檢測(cè)到pNF-H，在實(shí)驗(yàn)組1 及實(shí)驗(yàn)組2 的術(shù)后血樣中發(fā)現(xiàn)，手術(shù)剛開始的幾小時(shí)便出現(xiàn)pNF-H 溶度的上升，術(shù)后16 h 時(shí)出現(xiàn)第1 次溶度高峰，之后pNF-H 溶度下降，在術(shù)后3 d 出現(xiàn)溶度最高峰，之后數(shù)天內(nèi)pNF-H 溶度緩慢降低直至檢測(cè)不到。Shaw 等[25]指出，由于NF 只存在于神經(jīng)細(xì)胞當(dāng)中，NF 在血清中出現(xiàn)毫無(wú)疑問(wèn)說(shuō)明神經(jīng)細(xì)胞的破壞，實(shí)驗(yàn)組血樣pNF-H 雙峰溶度結(jié)構(gòu)考慮為脊髓的原發(fā)性損傷于繼發(fā)性損傷所致，但這一推測(cè)需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來(lái)證實(shí)。

3.2 pNF-H 測(cè)定在脊髓損傷動(dòng)物模型的驗(yàn)證性研究

基于Shaw 等[25]只是展示了脊髓損傷后血清中pNF-H出現(xiàn)雙峰現(xiàn)象，但這一雙峰現(xiàn)象或者說(shuō)pNF-H 溶度變化是一種與脊髓損傷程度無(wú)關(guān)的、獨(dú)立的反應(yīng)過(guò)程還是與脊髓損傷程度相一致尚且未知。 為此，2011 年Ueno 等[26]進(jìn)行了一項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來(lái)闡述這一問(wèn)題，將T10中度挫傷的SD 大鼠隨機(jī)分成兩組，對(duì)照組給予生理鹽水腹腔注射，實(shí)驗(yàn)組給予二甲胺四環(huán)素腹腔注射，注射頻率為2 次/d，持續(xù)注射3 d，分別于注射后1、2、3、4 d 采集尾靜脈血， 離心后收集血清進(jìn)行ELISA 檢測(cè)pNF-H 水平，在1、3、7、14、21、28 d 進(jìn)行BBB 大鼠行為學(xué)評(píng)分。 BBB 結(jié)果進(jìn)行U 檢驗(yàn)，兩組間血清pNF-H 結(jié)果進(jìn)行重復(fù)測(cè)量方差分析，BBB 結(jié)果與pNF-H 結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析。 結(jié)果顯示在注射3 d 后，四環(huán)素組pNF-H 開始較生理鹽水組降低，但統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，BBB 與pNF-H 呈負(fù)相關(guān)，考慮因?yàn)檠獦硬杉瘯r(shí)間過(guò)短，四環(huán)素的神經(jīng)保護(hù)作用尚未完全表現(xiàn)出來(lái)，所以四環(huán)素組pNF-H 與生理鹽水組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 文獻(xiàn)資料顯示四環(huán)素對(duì)脊髓損傷的治療效果一般在注射后7 d和14 d 能表現(xiàn)出來(lái)， 作者最后總結(jié)pNF-H 能夠評(píng)定脊髓損傷3 d內(nèi)神經(jīng)保護(hù)劑的神經(jīng)保護(hù)作用。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示pNF-H在大鼠的脊髓損傷程度的評(píng)價(jià)中能夠起到指導(dǎo)性作用。

2014 年Nishida 等[27]進(jìn)行了更加大型動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)研究，他們采用動(dòng)物是居民捐贈(zèng)的狗進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，6 只對(duì)照組，60只實(shí)驗(yàn)組，采用神經(jīng)功能學(xué)分類方法進(jìn)行評(píng)價(jià)，通過(guò)CT 和脊髓X 射線攝影診斷狗為脊髓損傷，且行減壓術(shù)時(shí)確診，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示grade 5 組的pNF-H 比grade 4 明顯，grade 5組中，pNF-H 水平很高的（平均4496 pg/mL）的狗沒有下肢活動(dòng)，而pNF-H 水平不算高（平均173 pg/mL）的下肢出現(xiàn)活動(dòng)，同時(shí)grade 4 組中（pNF-H 126 pg/mL）狗的下肢能動(dòng)，pNF-H 水平隨時(shí)間變化（第1、2、3 天）差異不顯著，grade 5 組顯示pNF-H 水平與預(yù)后存在相關(guān)性，cutoff 分析顯示最高值存在100.0%的特異性及34.8%的敏感性。實(shí)驗(yàn)一定程度上證實(shí)pNF-H 在大型哺乳動(dòng)物的脊髓損傷程度在評(píng)價(jià)中也可行。

3.3 pNF-H 測(cè)定在脊髓損傷的臨床研究

pNF-H 對(duì)腦外傷、腦出血、肌萎縮側(cè)索硬化癥等疾病的評(píng)價(jià)已經(jīng)從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究走向臨床實(shí)驗(yàn)研究，而pNF-H在臨床實(shí)驗(yàn)中將會(huì)取得怎樣的結(jié)果呢？ Hayakawa 等[7]在2012 年進(jìn)行了一項(xiàng)包括14 例患者的臨床實(shí)驗(yàn)。 病例為頸段脊髓損傷12 h 以內(nèi)的患者，病例跟蹤隨訪至少30 d，分別于傷后6 h、12 h、18 h、24 h、48 h、72 h、96 h、6 d、8 d、10 d、14 d、21 d 采集靜脈血，采用ELISA 方法測(cè)定血清pNF-H水平，在傷后12 h、7 d、30 d 進(jìn)行脊髓損傷水平（ASIA）評(píng)分。 結(jié)果顯示ASIA 組的pNF-H 從傷后12 h 開始上升一直到傷后96 h；ASIA A 組的pNF-H 水平較ASIA C～E 組高且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；ASIA C 組的pNF-H 水平較ASIA D 組高但差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；其中ASIA E 組中，1 例中央管綜合征患者的pNF-H 水平很高，但癥狀很輕，并且9 個(gè)月的隨訪結(jié)果顯示癥狀痊愈。 Hayakawa 等[7]總結(jié)雖然實(shí)驗(yàn)還存在或多或少的不足，但是從這當(dāng)中看到pNF-H 在臨床中評(píng)價(jià)脊髓損傷嚴(yán)重程度及病變過(guò)程可能還需要更多研究來(lái)證實(shí)。

4 展望

目前pNF-H 在脊髓損傷方面的研究還都是初級(jí)階段的實(shí)驗(yàn)性研究，這其中存在實(shí)驗(yàn)樣本量小、實(shí)驗(yàn)周期過(guò)短、評(píng)價(jià)方法單一、缺乏有效對(duì)照性、實(shí)驗(yàn)尚缺乏有力證據(jù)的結(jié)論等不足，這需要研究者們?cè)趧?dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床實(shí)驗(yàn)中做出更多的工作，但pNF-H 作為神經(jīng)細(xì)胞中含量最高的生物標(biāo)志物，具有不較其他標(biāo)志物的生物活性穩(wěn)定、生物特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[28]，將會(huì)有更多關(guān)于pNF-H 在脊髓損傷的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)領(lǐng)域及臨床領(lǐng)域的研究，pNF-H 將可為脊髓損傷后用藥指導(dǎo)及治療效果的實(shí)時(shí)追蹤提供參考，并在脊髓損傷的研究中越走越遠(yuǎn)。

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