慢性酒精中毒對清醒大鼠相關(guān)腦區(qū)部分氨基酸含量變化的影響

鄭雪梅， 許銀花， 金東春， 崔松彪， 吳 光

酒精的主要成分為乙醇，為親神經(jīng)物質(zhì)，是目前最常見的神經(jīng)毒性藥物。乙醇攝入體內(nèi)后分布于所有的組織和體液中，對其可產(chǎn)生多方面的破壞作用。對乙醇成癮是酒精中毒的一個主要特征，長期反復飲酒可產(chǎn)生慢性中毒。

本實驗采用慢性酒精中毒大鼠自由飲模型，利用高效液相色譜法及腦內(nèi)微透析采樣技術(shù)在大鼠清醒狀態(tài)下測定慢性酒精中毒時蒼白球腹側(cè)核和中腦腹側(cè)被蓋區(qū)細胞外液中部分氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)的含量，觀察慢性酒精中毒時蒼白球腹側(cè)核和中腦腹側(cè)被蓋區(qū)氨基酸含量變化的影響。

1 材料與方法

1.1 動物模型制備 實驗選用成年Wistar雄性大鼠40只，體質(zhì)量(370±30)g，隨機分成對照組、6%酒精組、8%酒精組、12%酒精組，每組各10只，由延邊大學醫(yī)學部實驗動物科提供。模型組大鼠單籠飼養(yǎng)，連續(xù)自由飲含低濃度乙醇(6%、8%、12%)的水溶液4 m，建立慢性酒精中毒動物模型。適應階段，按酒精濃度從低到高，經(jīng)過7 d達到設計酒精濃度:6%酒精組每2 d遞增1.5%(1.5%→3%→4.5%→6%)，以后維持在6%的水平至造模結(jié)束;8%酒精組每2d遞增2%(2%→4%→6%→8%)，以后維持在8%的水平至造模結(jié)束;12%酒精組每2 d遞增3%(3%→6%→9%→12%)，以后維持在12%的水平至造模結(jié)束。模型組以含各濃度乙醇的水溶液作為大鼠唯一飲水來源，24 h自由飲，任意進食。造模期間大鼠死亡率為0%，對照組大鼠皮毛光澤，行動靈活，食量及大便正常，模型組大鼠在造模期間出現(xiàn)行動遲緩、睡眠多、情緒不穩(wěn)等癥狀，進食量少于對照組，體質(zhì)量增長較對照組緩慢，12%酒精組的變化尤為顯著。

1.2 手術(shù)方法 大鼠稱重，用10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔麻醉，俯臥位固定于大鼠立體腦定位儀上，大鼠牙槽低于耳內(nèi)切線3.3 mm。參照Bliss［1］等的方法進行腦部定位。根據(jù) Paxinos和Watson［2］圖譜，將透析探針套管插入到蒼白球腹側(cè)核(VP)(前囟后0.26 mm，旁開2.5 mm，顱骨下8.4 mm)、中腦腹側(cè)被蓋區(qū)(VTA)(前囟后6.04 mm，旁開0.5 mm，顱骨下8.7 mm)。術(shù)后，待動物狀態(tài)恢復正常時，將透析導管(作用透析膜1.0 mm)插入透析套管內(nèi)，待收集灌流液。

1.3 腦部微量透析及樣本收集 動物術(shù)后當天微量透析探針連接微量泵，以1.5μl/min速度向大鼠VP區(qū)灌流Ringer’s液，穩(wěn)定30 min，同時經(jīng)樣本收集器連續(xù)收集樣本3管，每管收集10 min，收集量為15μl。隨后收集VP區(qū)樣本，并使用相同方法收集VTA區(qū)樣本，再次收集灌流液3管，-80℃冰箱中冷凍保存，以備進行氨基酸含量的分析。

1.4 氨基酸含量分析方法 參照Jin等方法［3］配制衍生劑1溶液和衍生劑2溶液。取收集好的樣本12μl和4 mmol/L的OPA溶液在室溫下反應2.5 min，抽取反應液10μl，注入到生物活性物質(zhì)微量分析系統(tǒng)(日本Eicom公司產(chǎn))。以0.5 ml/min速度通過高效液相分離柱(SC-50DS)和電化學檢測器(ECD-300)測定樣本中氨基酸的含量。每次樣本分析均以稀釋的氨基酸標準液(2 ml)作為基礎。

1.5 統(tǒng)計學方法 數(shù)據(jù)以均值±標準差(χ±s)表示，用SPSS11.5統(tǒng)計軟件包進行了t檢驗，P＜0.05有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 慢性酒精中毒對大鼠VP區(qū)氨基酸的影響 與正常組相比，6%酒精組大鼠細胞外液Gly、Tau、Ala含量增高(P＜0.05);12%酒精組大鼠細胞外液Gln、Asp含量明顯減少(P＜0.01)(見表1)。

2.2 慢性酒精中毒對大鼠VTA區(qū)的氨基酸的影響 與正常組相比，6%酒精組大鼠細胞外液Asp含量明顯增高(P＜0.01);12%和8%酒精組大鼠細胞外液 Asp、Glu、Ala、Gly、Gln 含量均增高，而 Tau含量在VTA區(qū)無明顯變化(見表2)。

表1 VP區(qū)氨基酸的變化(χ ± s，n=10)

表2 VTA區(qū)氨基酸的變化(χ ± s，n=10)

3 討論

中腦-邊緣系統(tǒng)多巴胺神經(jīng)元與乙醇依賴的關(guān)系極為密切，多巴胺參與獎賞和增強等神經(jīng)機制，乙醇則優(yōu)先增強腦區(qū)多巴胺釋放［4］?，F(xiàn)在更多的研究發(fā)現(xiàn)該神經(jīng)通路還與成癮渴求和復發(fā)有關(guān)。VTA多巴胺神經(jīng)元投射到邊緣系統(tǒng)有關(guān)腦區(qū)的通路，成為中腦-邊緣多巴胺系統(tǒng)，中腦-邊緣系統(tǒng)中多巴胺獎賞回路中主要組成部分中一些神經(jīng)元可投射到蒼白球(VP)或通過VP投射到其它腦區(qū)［5］，故本實驗測定清醒自由狀態(tài)下的慢性酒精中毒大鼠VP區(qū)及VTA區(qū)細胞外液中的部分氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)含量的變化。

既往研究神經(jīng)遞質(zhì)的變化多采用離體勻漿法分析，測定出來的是一種靜態(tài)的、混雜的結(jié)果，它代表細胞內(nèi)和細胞外的物質(zhì)含量總和。但目前多利用比較先進的對神經(jīng)細胞間隙(細胞外液)進行動態(tài)檢測來測定神經(jīng)遞質(zhì)含量的變化，即腦內(nèi)微透析取樣技術(shù)。所謂腦內(nèi)微透析取樣技術(shù)是一種連續(xù)灌注并采集活體動物特定腦區(qū)內(nèi)灌流液的新方法，其優(yōu)點是透析液中不含有大分子物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、酶等等，取樣無需勻漿，避免了復雜的采樣前處理過程，可真實代表取樣位點目標化合物的濃度;并且對腦組織的損傷非常輕微，因此廣泛應用于定量分析大腦細胞外液中的各種神經(jīng)遞質(zhì)的濃度變化［6］，微透析取樣技術(shù)和微量化學分析技術(shù)結(jié)合可精確測定動物在清醒狀態(tài)下的特定腦區(qū)的神經(jīng)遞質(zhì)濃度變化情況。

神經(jīng)元之間的信息交流主要是通過化學傳遞來完成，中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)大部分信息交流是以神經(jīng)遞質(zhì)釋放、與受體結(jié)合而引發(fā)生理效應的方式來進行。氨基酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)數(shù)量最多、分布最廣的神經(jīng)遞質(zhì)，它們不僅具有代謝作用，還作為神經(jīng)遞質(zhì)對維持正常的腦功能起著重要作用，根據(jù)作用可分為兩大類，即興奮性氨基酸遞質(zhì)，如谷氨酸、天冬氨酸;抑制性氨基酸遞質(zhì)，為甘氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸、?；撬岬鹊?。近年來通過很多研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血時細胞外液興奮性和抑制性氨基酸遞質(zhì)均增高。興奮性氨基酸是一種神經(jīng)毒素，在細胞外液堆積產(chǎn)生興奮毒性作用，腦缺血時抑制性氨基酸遞質(zhì)釋放也反應性上升以維持興奮性和抑制性氨基酸遞質(zhì)的動態(tài)平衡［7］，以此對抗興奮性氨基酸的毒性作用。本實驗研究結(jié)果顯示，長期低濃度給予酒精時，VTA區(qū)興奮性氨基酸和抑制性氨基酸均增高，如12%和8%酒精組大鼠細胞外液 Asp、Glu、Ala、Gly、Gln含量均增高，故我們可推測慢性酒精中毒時大鼠VTA區(qū)中有兩類不同氨基酸神經(jīng)遞質(zhì)共同參與，這一結(jié)果與許銀花［8］等研究的急性酒精中毒時大鼠海馬 DG區(qū)Asp、Glu和Gly含量增加的結(jié)果類似，但6%酒精組僅使興奮性氨基酸如Asp、Glu含量增高，這可能與大鼠飲酒量、飲酒時間及飲酒濃度有關(guān)。VP區(qū)6%酒精組大鼠細胞外液 Gly、Tau、Ala含量增高;而12%酒精組大鼠細胞外液Asp、Gln含量明顯減少，這可能破壞了氨基酸的動態(tài)平衡，F(xiàn)aigold等研究證實長期反復飲酒可導致腦內(nèi)興奮性氨基酸和抑制性氨基酸的失衡［9］，故對機體產(chǎn)生不良影響。

綜上所述，慢性酒精中毒與蒼白球腹側(cè)核區(qū)Gly、Tau、Ala含量增加有關(guān);與蒼白球腹側(cè)核區(qū)Gln、Asp含量減少有關(guān);并且與中腦腹側(cè)被蓋區(qū)Asp、Glu、Ala、Gly、Gln含量增加有關(guān)。本實驗應用慢性酒精中毒大鼠自由飲模型，選用了與多巴胺能神經(jīng)元功能關(guān)系密切的VP及VTA區(qū)，研究長期飲酒后腦內(nèi)部分氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)含量變化，為臨床預防乙醇對人體的損害提供理論依據(jù)和實驗基礎。

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