微囊藻毒素-LR超靈敏均相免疫分析方法的建立與優(yōu)化

張 藝，黃 飚，鈕偉民，趙燦培，金 堅(jiān)

(1.江南大學(xué)藥學(xué)院藥物設(shè)計(jì)與分子藥理室，江蘇無錫 214122;2.江蘇省原子醫(yī)學(xué)研究所衛(wèi)生部核醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇省分子核醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫 241063;3.無錫市疾病預(yù)防控制中心檢驗(yàn)部，江蘇無錫 214023)

微囊藻毒素(microcystin，MC)是在藍(lán)藻水華污染中出現(xiàn)的最廣泛、毒性最大的一類毒素，由7個(gè)氨基酸組成，并且有多種異構(gòu)體形式，其中含量高、毒性大、研究最深入、報(bào)道最多的異構(gòu)體是MC-LR，它對(duì)人體有很強(qiáng)的肝毒性，影響機(jī)體免疫功能，明顯抑制吞噬細(xì)胞、T細(xì)胞和B細(xì)胞功能和腫瘤壞死因子α的基因轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，嚴(yán)重時(shí)可誘發(fā)肝癌［1－2］。然而，隨著淡水水體的富營(yíng)養(yǎng)化加劇，各地藍(lán)藻水華時(shí)有爆發(fā)［3］。因此，1998年世界衛(wèi)生組織制定了飲用水中 MC-LR 含量低于 1.0 μg·L－1的指導(dǎo)標(biāo)準(zhǔn);我國(guó)也于2006年制定了相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》［4－5］。為了更好地監(jiān)測(cè)水體中藻毒素的含量，許多檢測(cè)技術(shù)已經(jīng)投入應(yīng)用。目前，檢測(cè)方法主要有物理化學(xué)法(如:高效液相色譜法、液質(zhì)聯(lián)用分析法)、生物化學(xué)方法(常見的有蛋白磷酸酶分析法)、分子生物學(xué)方法(PCR法)以及免疫分析法(放免、酶免、時(shí)間分辨熒光免疫分析法等)［7－13］。免疫檢測(cè)技術(shù)，基于抗原抗體之間的特異性反應(yīng)，相對(duì)簡(jiǎn)便、快速，適用于定量檢測(cè)，因儀器價(jià)格合理，操作方便，近年來廣受關(guān)注，使用率也越來越高。鑒于此，建立一種快捷靈敏的免疫檢測(cè)MC-LR的方法，先將毒素含量超標(biāo)的水體采樣篩選出來，再采用精確繁復(fù)的物理儀器確定，將利于對(duì)水環(huán)境實(shí)施快速監(jiān)測(cè)，對(duì)人民健康具有積極作用。本研究基于光激化學(xué)發(fā)光均相免疫檢測(cè)方法(AlphaLISA)，利用抗體-抗原間的特異性反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)高靈敏和快速檢測(cè)樣本中MC-LR的含量。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

MC-LR、氰基硼氫化鈉、2-(N-)嗎啉-乙磺酸(2-［N-morpholino］ethanesulfonic acid，MES)和羧甲氧基半鹽酸鹽(carboxymethlamine hemihydrochloride，CMO)，美國(guó) Sigma-Aldrich公司;MC-LR-BSA、MC-RR、MC-LR和抗MC-LR多克隆抗體，無錫市疾病預(yù)防控制中心提供;生物素-羊抗兔IgG抗體，華美生物工程公司;AlphaLISA發(fā)光球和包被鏈霉親和素的感光微球，美國(guó)PE公司;其他試劑均為國(guó)藥分析純。AlphaLISA免疫檢測(cè)儀(Lica HT)，由上海博陽(yáng)生物科技公司生產(chǎn)。

1.2 MC-LR－BSA發(fā)光微球的制備

首先將1 mg發(fā)光微球、0.05 mg MC-LR-BSA和 12.5 μL 的 1% 吐溫-20 溶液，以及 10 μL 的25 g·L－1的氰基硼氫化鈉混合在離心管中，然后用0.01 mol·L－1的 MES 溶液(pH 6.0)補(bǔ)充至200 μL體積，令上述溶液充分混合后37℃反應(yīng)過夜。次日，加入10 μL CMO 0.3 mol·L－1(pH 5.0)終止連接反應(yīng)，37℃孵育1 h。之后，連有MC-LR-BSA的發(fā)光微球離心濃縮，再超聲混勻以提純，重復(fù)上述步驟2次。最后，將微球溶于含有0.1%Proclin-300的 PBS(pH 7.4)，2 ～8℃保存。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)品工作液的制備

將MC-LR原液溶于甲醇，再用PBS(pH 7.4)稀釋至0.1，0.2，0.5，1.0 和 5.0 μg·L－1，0 濃度點(diǎn)即為對(duì)應(yīng)的PBS溶液。

1.4 抗體稀釋度的選擇

將一抗分別稀釋1∶100到1∶8000，測(cè)定對(duì)應(yīng)的零濃度點(diǎn)結(jié)合率(Bound 0，B0)，再通過稀釋度曲線，選取斜率最大即ED50時(shí)的稀釋度，獲得本研究最佳一抗稀釋比。

在一抗?jié)舛冗x取的基礎(chǔ)上，再調(diào)整二抗生物素-羊抗兔的稀釋倍數(shù)，測(cè)定其從1∶100至1∶10 000時(shí) B0和非特異性結(jié)合(non-specific bounding，NSB)的熒光值，以獲得高結(jié)合率和較低的NSB。

1.5 反應(yīng)緩沖液的選擇

分別制備 pH 7.4 PBS 0.05 mol·L－1、Tris-HCl和 HEPES 緩沖液，均加入 0.2%BSA、0.1%吐溫-20，2～8℃保存?zhèn)溆?。在AlphaLISA反應(yīng)時(shí)用上述溶液稀釋試劑，按照反應(yīng)步驟操作，分別測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)品工作液。根據(jù)各濃度點(diǎn)熒光值，確定最佳反應(yīng)緩沖液。

1.6 樣品的制備

因 MC 在0 ～200 μg·L－1時(shí)溶于水［6］，澄清水樣可直接檢測(cè);若樣本混濁，則取2 mL混勻水樣置于離心管中，3188×g離心20 min，轉(zhuǎn)移上清待測(cè)。

樣本中MC-LR的提取:含藻水樣的MC-LR存在于胞外和胞內(nèi)，通過20 MHz超聲波間歇振蕩2 h，破碎藻細(xì)胞，釋放胞內(nèi)MC;再按照上述步驟離心取澄清部分，獲得總MC-LR。

所有水樣均由無錫市疾控中心提供，取自太湖沿岸水廠。

1.7 檢測(cè)步驟

取包被有MC-LR的發(fā)光微粒、標(biāo)準(zhǔn)品或處理好的樣品、一定濃度的抗MC-LR抗體和生物素化二抗共4種試劑各20 μL加至白色不透明微孔板，37℃孵育;加入包被有鏈霉親和素的感光微粒，37℃孵育。在Lica HT檢測(cè)儀上檢測(cè)光信號(hào)，從標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)算出樣品中的MC-LR含量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Origin8.0軟件進(jìn)行處理，顯著性分析采用t檢驗(yàn)，P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 抗體工作濃度的選擇

結(jié)合儀器熒光計(jì)數(shù)效率，兼顧計(jì)數(shù)誤差，分析抗體稀釋度曲線的二次導(dǎo)函數(shù)為0的最大和最小值之間的斜率最大部分，定位ED50為最適抗體工作濃度，結(jié)果見圖1。即抗體稀釋度為1∶1000時(shí)，以此作為本研究合適的工作濃度。

Fig.1 Dilution curve of polyclonal antibody by microcystin(MC)-LR AlphaLISA.Series diluted polyclonal antibodies were added to wells with blank sample by MC-LR AlphaLISA.Each dilution was tested twice.B100:bound 100;standing for counts per second(cps)of zero concentration，when dilution rate was 1∶100.n=2.

2.2 二抗反應(yīng)濃度的確定

在兔多抗?jié)舛葹?∶1000時(shí)，對(duì)生物素－羊抗兔的濃度進(jìn)行了選擇，并比較了對(duì)應(yīng)的NSB的干擾熒光值，結(jié)果見圖2。當(dāng)二抗?jié)舛仍?∶200時(shí)，有最高的熒光值(B0最大)和相對(duì)較低的NSB，即最佳信噪比B0/NSB。因此，選擇此濃度為生物素二抗反應(yīng)濃度。

2.3 反應(yīng)體系的選擇

為考察反應(yīng)緩沖液對(duì)本研究反應(yīng)體系的影響，分別采用HEPES，PBS和Tris-HCl稀釋各試劑進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見圖3。當(dāng)采用PBS和Tris-HCl緩沖液時(shí)，對(duì)競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)的影響差異不大;而用HEPES時(shí)，發(fā)光效率較低。因PBS緩沖體系在免疫反應(yīng)中較為常用，所以本研究選用PBS緩沖液。

Fig.2 Bound 0(B0)/non-specific bounding(NSB)change in different dilutions of biotinylated second antibody.Biotinylated second antibody was diluted from 1∶100 －1∶10 000 to get higher bounding with lower NSB in competitive MC-LR system.n=2.

Fig.3 Standard curves of MC-LR with HEPES，PBS and Tris-HCl buffer by AlphaLISA.MC-LR AlphaLISA was optimized in different reaction buffer，which was HEPES，PBS and Tris-HCl，respectively.

2.4 反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化

免疫反應(yīng)的時(shí)間對(duì)于抗原抗體的結(jié)合速度影響較大，一般隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，結(jié)合率會(huì)升高，相應(yīng)零濃度點(diǎn)的熒光值越高。而獲得又快又準(zhǔn)的熒光計(jì)數(shù)也是方法建立時(shí)的目標(biāo)，由圖4可知，在37℃反應(yīng)，MC-LR AlphaLISA第一步時(shí)間延長(zhǎng)結(jié)合率更高，30 min后結(jié)合率升高不明顯(圖4A);第二步反應(yīng)速度相當(dāng)較快，10 min后達(dá)到穩(wěn)定(圖4B)。因此，選用第一步反應(yīng)30 min，第二步10 min作為本方法的反應(yīng)時(shí)間。

2.5 MC-LR的AlphaLISA均相免疫分析法

經(jīng)2.1～2.4反應(yīng)條件的優(yōu)化，得到競(jìng)爭(zhēng)法MC-LR AlphaLISA的對(duì)數(shù)擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線和精確性分析如圖5所示。

2.6 方法學(xué)考核

2.6.1 靈敏度和穩(wěn)定性

Fig.4 Effect of different time on first reaction(A)and second reaction(B).At 37℃，B0of different reaction times，5－40 min，was compared by MC-LR AlphaLISA method in the first step and second step.n=2.

Fig.5 Standard curves and coefficient variation of MC-LR AlphaLISA.The best reaction condition confirmed in this research was that the dilution rate of poly antibody and biotinylated goat anti rabbit was 1∶1000 and 1∶200，respectively，PBS was used as the reaction buffer，the reaction time of first and second step was 30 min and 10 min，respectively.MC-LR standards were determinated twice under the condition mentioned above.n=2.

2.6.2 準(zhǔn)確性與精密度

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍和有效劑量值，在每份空白樣品中分別添加低中高濃度的MC-LR標(biāo)準(zhǔn)品，每份樣品重復(fù)測(cè)定3次MC-LR含量，取平均，計(jì)算實(shí)測(cè)值與添加值之比，可得到樣品的添加回收率，即競(jìng)爭(zhēng)型MC-LR準(zhǔn)確性。相同實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次后，考核其變異系數(shù)，由此表征本方法的精密度。結(jié)果見表1。

Tab.1 Accuracy and precision of MC-LR AlphaLISA

2.6.3 健全性

取高濃度樣本經(jīng)離心得上清液，稀釋2，5和20 倍后分別添加到 0.1 ～5.0 μg·L－15 個(gè)參考標(biāo)準(zhǔn)品中，按檢測(cè)程序測(cè)定，各稀釋濃度測(cè)定值分別做曲線與標(biāo)準(zhǔn)品曲線比較。圖6顯示，以3種稀釋液為基質(zhì)，測(cè)定結(jié)果呈線性，與標(biāo)準(zhǔn)曲線重合或平行，本研究建立的檢測(cè)方法健全性良好。

Fig.6 Validity curves of MC-LR AlphaLISA.The validity was estimated by the comparison of calibration curves constructed both before and after dilution of a series of positive samples with high amounts of MC-LR.The dilution rate was 2-fold，5-fold，and 20-fold，respectively.STD:standard curve without spiked;S1，S2 and S3:spiked with 2-fold，5-fold，and 20-fold dilution of high concentration samples，respectively.n=2.

2.6.4 特異性

MC-RR和MC-RY是MC-LR的結(jié)構(gòu)類似物，分別將其稀釋至 5 μg·L－1后復(fù)孔檢測(cè) MC-LR AlphaLISA，交叉反應(yīng)率分別為13.2%和0.91%。

2.7 水樣檢測(cè)

隨機(jī)選取水樣檢測(cè)時(shí)，經(jīng)離心取澄清檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)含藍(lán)藻的水體僅1 例超出1.0 μg·L－1的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，其余15例均符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。經(jīng)過超聲波破壁處理后，MC-LR釋出，渾濁樣本組的超標(biāo)率增加至7例，產(chǎn)生了顯著差異(P＜0.05)。而一般澄清水體超聲前后，MC-LR含量變化不大 ，且沒有超標(biāo)樣本出現(xiàn)?？梢?，與相關(guān)報(bào)道一致［15］，MC-LR的含量與藍(lán)藻密度、藻體是否分解有關(guān)。

Tab.2 MC-LR detection of water samples

3 討論

隨著工業(yè)發(fā)展和農(nóng)藥濫用，很多污染物未經(jīng)處理直接排放入江湖之中，造成水體藍(lán)藻暴發(fā)事件時(shí)有發(fā)生［14－15］。

本實(shí)驗(yàn)采用的AlphaLISA被譽(yù)為免洗的ELISA方法，于2008年問世，有快速、穩(wěn)定、高靈敏、無放射污染和操作簡(jiǎn)單的特點(diǎn)，技術(shù)核心是單線態(tài)氧的產(chǎn)生和傳遞，基于直徑200 nm的微球?qū)崿F(xiàn)，即本方法運(yùn)用的發(fā)光微球和感光微球［16－17］。因此，該方法不同于傳統(tǒng)的酶免、放免，避免了異相的洗滌過程，從而減少了操作誤差，進(jìn)而得到較好的精密度，本方法的CV＜10%。由于采用微粒技術(shù)，使得反應(yīng)的比表面積增加，抗體抗原之間的免疫應(yīng)答更易進(jìn)行，小分子的MC-LR更容易被抗體所捕獲，從而縮短了反應(yīng)時(shí)間，提高了反應(yīng)的靈敏度。與傳統(tǒng)的免疫反應(yīng)至少需要1 h，且不包括顯色時(shí)間，相對(duì)地，AlphaLISA從第一步加樣到完成檢測(cè)本方法耗時(shí)40 min，較其他異相免疫方法節(jié)約時(shí)間。本方法上樣量每孔 20 μL，靈敏度達(dá)到0.006 μg·L－1，較時(shí)間分辨熒光免疫分析法的每孔50 μL和靈敏度0.01 μg·L－1［13］相比，試劑消耗少，反應(yīng)靈敏。

在水樣檢測(cè)部分，通過超聲波破碎，將藍(lán)藻胞內(nèi)MC-LR釋放，與未破膜的結(jié)果產(chǎn)生顯著差異，說明:胞外藻毒素只是藍(lán)藻在代謝中產(chǎn)生的一部分毒素，而大量的毒素在藻體死亡后仍可能釋放溶出，造成環(huán)境污染，對(duì)人類造成健康威脅。

通過考察抗體的反應(yīng)濃度、反應(yīng)體系、反應(yīng)時(shí)間，本文建立了一種MC-LR的高靈敏AlphaLISA均相檢測(cè)方法，其檢測(cè)范圍0.006 ～5 μg·L－1，能夠滿足國(guó)家對(duì)于飲用水MC-LR的限量標(biāo)準(zhǔn)。其變異系數(shù)小于10%，回收率介于80～120%，平均回收率107.7%，表明方法穩(wěn)定，準(zhǔn)確。因本方法免疫反應(yīng)時(shí)間＜1 h，是目前相對(duì)快速的免疫檢測(cè)手段，上樣量小，適于國(guó)內(nèi)多水域以及水源水的大樣本監(jiān)測(cè)。

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