正常淋巴液對內(nèi)毒素休克小鼠內(nèi)毒素增敏系統(tǒng)的作用＊

崔 浩 孫自賢 崔 穎 陳偉紅 張立民 趙自剛 牛春雨

內(nèi)毒素休克（Endotoxic Shock，ES）引起的多器官損傷是患者死亡的重要原因之一［1，2］。脂多糖結(jié)合蛋白（Lipopolysaccharide-Binding Protein，LBP）和脂多糖受體（Lipopolysaccharide Receptor，CD14）可提高機(jī)體多種細(xì)胞對細(xì)菌內(nèi)毒素或脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）的敏感性，使內(nèi)毒素的生物活性提高數(shù)百倍甚至數(shù)千倍，是內(nèi)毒素激活體內(nèi)炎性細(xì)胞合成和分泌大量細(xì)胞因子、引起失控性炎癥反應(yīng)、誘發(fā)組織和器官損傷的重要增敏系統(tǒng)［3，4］，在膿毒癥的發(fā)展進(jìn)程中起到重要作用［5］。本課題組在前期以靜脈輸入LPS方法建立大鼠內(nèi)毒素休克模型時發(fā)現(xiàn)，輸入來自正常犬的腸淋巴液可有效改善內(nèi)毒素休克大鼠的血液微循環(huán)障礙及淋巴微循環(huán)障礙［6］，改善肝、腎器官的血液灌注量［7］，降低重要組織器官的黏附分子水平、髓過氧化物酶活性［8］，降低炎癥反應(yīng)、自由基含量和組織損傷［8，9］；Cheng等［10］的 研 究 也 發(fā) 現(xiàn)，正 常 腸 淋 巴 液（Normal Mesenteric Lymph，NML）能降低內(nèi)毒素導(dǎo)致的肺血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附分子表達(dá)和炎癥反應(yīng)?？梢姡Ｄc淋巴液對內(nèi)毒素休克具有一定的干預(yù)作用，這也可能是未來防治內(nèi)毒素休克的有效藥物靶點(diǎn)。但內(nèi)毒素致敏系統(tǒng)在正常淋巴液干預(yù)內(nèi)毒素休克器官損傷過程中，究竟發(fā)揮什么作用尚不清楚。為此，本研究側(cè)重觀察正常腸淋巴液對內(nèi)毒素休克內(nèi)毒素致敏系統(tǒng)的作用。

1 材料與方法

1.1 引流正常淋巴液

18只SPF級、體質(zhì)量20g-25g的BALC／c雄性小鼠（中國食品藥品檢定研究院，許可證號SCXK（京）2009-0017）用于正常淋巴液引流。操作方法：小鼠經(jīng)1%戊巴比妥鈉（50mg／Kg，德國／北京化學(xué)試劑公司分裝）腹腔注射麻醉后，在腹部正中線偏右作一長2cm縱行切口，打開腹腔，暴露腸系膜根部，在手術(shù)顯微鏡下行腸淋巴管插管，持續(xù)引流腸淋巴液60min，引流的淋巴液量為每只小鼠20μl-60μl。然后以1 500rpm離心5min，取上清液置于低溫冰箱（-75℃）冷凍備用。實驗過程中的動物處置方法符合動物醫(yī)學(xué)倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 復(fù)制內(nèi)毒素休克小鼠模型及正常淋巴液干預(yù)

另取18只SPF級、體質(zhì)量20g-25g的BALC／c雄性小鼠（來源同上）隨機(jī)均分為假休克組（sham shock，SS組）、內(nèi)毒素休克模型組（ES組）、正常腸淋巴液干預(yù)內(nèi)毒素休克組（簡稱腸淋巴液干預(yù)組）（NML+ES組）。

小鼠經(jīng)腹腔注射戊巴比妥鈉（50mg／Kg）全身麻醉后，在手術(shù)顯微鏡下行股部手術(shù)：鈍性分離股動脈，經(jīng)股動脈注射1%肝素鈉（1ml／Kg）全身抗凝，插管，通過三通管連接RM6240BD型生物信號采集系統(tǒng)（成都儀器廠），連續(xù)監(jiān)測整個實驗過程中的平均動脈血壓（Mean Artery Pressure，MAP）。術(shù)后穩(wěn)定30min，ES組和NML+ES組小鼠腹腔注射LPS（O111：B4，美國Sigma公司）；質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%，35mg／Kg），成功復(fù)制內(nèi)毒素休克模型［11］。

在LPS注射60min后，NML+ES組小鼠經(jīng)股動脈［12，13］輸入正常淋巴液，輸入量參照本課題組前期研究結(jié)果［6-9］確定為小鼠全血量的1／15（全血量為小鼠體重的1／13），大約100μl-150μl，輸注完成后加推少量生理鹽水，以確保淋巴液全部注入體內(nèi)。

ES組僅注射等量的生理鹽水；SS組小鼠僅實施與其它兩組小鼠完全相同的手術(shù)，不腹腔注射LPS，不輸入正常淋巴液，只在相同時間點(diǎn)輸入等量生理鹽水。

1.3 標(biāo)本制備

在腹腔注射LPS后6h麻醉小鼠，迅速摘取各組小鼠的肺、心臟、肝臟，置于無菌EP管中，-75℃凍存（702型低溫冰箱，美國熱電公司）。實驗時取出凍存的肺、肝、心肌組織，分析天平稱重后，按1∶9比例，加入4℃生理鹽水，在冰浴環(huán)境中，應(yīng)用FJ-200型高速分散勻質(zhì)機(jī)（上海標(biāo)本模型廠）制備10%組織勻漿，使用Labofuge 400R型高速低溫離心機(jī)（德國科峻公司）于0℃-4℃、3 000r／min離心10min，取上清用于相關(guān)指標(biāo)檢測。

1.4 指標(biāo)檢測

應(yīng)用小鼠LBP、CD14、腫瘤壞死因子（Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α）、白介素 6（Interleukin 6，IL-6）ELISA檢測試劑盒（美國R＆D公司生產(chǎn)、江蘇鎮(zhèn)江厚普生物科技有限公司合成），先按試劑盒說明書繪制 LBP、CD14、TNF-α、IL-6標(biāo)準(zhǔn)曲線（曲線方程分別為 y＝0.128x+0.003x2-0.0001874x3，r2＝0.9992；y＝0.061x-0.00004486x2-0.000004574x3，r2＝0.9995；y＝0.016x-0.0004087x2+0.00000006004x3，r2＝0.9977；y＝0.045x-0.00005297x2-0.000003114x3，r2＝0.9993）；再按步驟檢測各組小鼠組織勻漿的LBP、CD14、TNF-α、IL-6含量。檢測儀器為SpectraMax M3型全自動酶標(biāo)儀（美國 MD公司），OD值于450nm處獲得。組織勻漿的蛋白定量采用Bradford法（試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所）。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件。實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，方差齊性資料多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較或組內(nèi)比較均用t檢驗；方差不齊性資料采用Kruskal Wallis檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠多器官組織勻漿LBP含量比較

ES組肺、肝、心肌勻漿的LBP含量均顯著高于SS組（P＜0.05）；NML+ES組肺、心肌勻漿LBP含量較ES組明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），且與SS組無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。見表1。

表1 各組小鼠多器官組織勻漿LBP含量（ng／g protein）（±s，n均＝6）

表1 各組小鼠多器官組織勻漿LBP含量（ng／g protein）（±s，n均＝6）

注：與SS組比較，1）P＜0.05；與 ES組比較，2）P＜0.05

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2.2 各組小鼠多器官組織勻漿CD14含量比較

ES組肺、肝、心肌勻漿CD14含量明顯高于SS組（P＜0.05）；NML+ES組心肌勻漿CD14含量與ES組比較顯著降低（P＜0.05），但肝、肺組織勻漿CD14含量與ES組比較無顯著下降（P＞0.05）。見表2。

表2 各組小鼠多器官組織勻漿CD14含量（ng／g protein）（±s，n均＝6）

表2 各組小鼠多器官組織勻漿CD14含量（ng／g protein）（±s，n均＝6）

注：與SS組比較，1）P＜0.05；與 ES組比較，2）P＜0.05

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2.3 各組小鼠多器官組織勻漿TNF-α含量比較

ES組肺、肝、心肌勻漿TNF-α含量顯著高于SS組（P＜0.05）；NML+ES組肺、肝、心肌勻漿TNF-α含量均顯著低于ES組（P＜0.05）。見表3。

表3 各組小鼠多器官組織勻漿TNF-α含量（ng／g protein）（±s，n均＝6）

表3 各組小鼠多器官組織勻漿TNF-α含量（ng／g protein）（±s，n均＝6）

注：與SS組比較，1）P＜0.05；與 ES組比較，2）P＜0.05

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2.4 各組小鼠多器官組織勻漿IL-6含量比較

ES組肺、肝、心肌勻漿IL-6含量均顯著高于SS組（P＜0.05）；NML+ES組肝、心肌勻漿IL-6含量顯著低于ES組（P＜0.05），且與SS組無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。見表4。

表4 各組小鼠多器官組織勻漿IL-6含量（ng／g protein）（±s，n均＝6）

表4 各組小鼠多器官組織勻漿IL-6含量（ng／g protein）（±s，n均＝6）

注：與SS組比較，1）P＜0.05；與 ES組比較，2）P＜0.05

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3 討 論

引起內(nèi)毒素休克的原因很多，研究者根據(jù)不同致病因素建立了多種內(nèi)毒素休克模型，如靜脈輸入LPS或菌液［14，15］模擬腸源性細(xì)菌、內(nèi)毒素移位引起的菌血癥、敗血癥休克；腹腔注射LPS或菌液［11-13，16］，模擬急性腹腔感染引起的內(nèi)毒素性休克；還有以盲腸結(jié)扎穿孔［17，18］模擬腸穿孔引起腹腔感染等均有一定的代表性和臨床意義。

本課題組在前期研究中，應(yīng)用靜脈輸入LPS導(dǎo)致大鼠內(nèi)毒素休克模型驗證了異種正常腸淋巴液對內(nèi)毒素休克微循環(huán)、血液灌注量、白細(xì)胞黏附以及器官損傷具有良好的干預(yù)作用。為了進(jìn)一步擴(kuò)展正常淋巴液的藥理學(xué)作用，本文應(yīng)用腹腔注射LPS的方法復(fù)制了小鼠內(nèi)毒素休克模型，結(jié)果顯示小鼠MAP在腹腔注射LPS后90min-360min的多個時間點(diǎn)顯著低于假休克組，并出現(xiàn)了內(nèi)毒素性休克的典型血壓變化，即先下降，后緩慢回升，繼續(xù)下降至較低水平，尤其是在340min以后（結(jié)果將另文發(fā)表），表明該模型是成功的。

已有研究表明，LPS除了直接損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞、組織實質(zhì)細(xì)胞外，更重要的是其與LBP結(jié)合形成的LPS-LBP復(fù)合物與單核巨噬細(xì)胞表面的CD14結(jié)合后激活免疫細(xì)胞引起失控性炎癥反應(yīng)，成為LPS導(dǎo)致組織損傷的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。因此，LBP／CD14系統(tǒng)也被稱作內(nèi)毒素增敏系統(tǒng)［19，20］。為了進(jìn)一步揭示正常腸淋巴液干預(yù)內(nèi)毒素休克的作用機(jī)制，本文進(jìn)一步觀察了正常腸淋巴液對內(nèi)毒素休克小鼠肺、肝、心肌組織LBP／CD14以及炎癥因子TNF-α、IL-6含量的影響。結(jié)果顯示，小鼠在受到內(nèi)毒素攻擊后，肺、肝、心肌組織的LBP、CD14含量均顯著升高，成為LPS導(dǎo)致器官炎癥反應(yīng)的重要環(huán)節(jié)，致使這些器官組織的炎癥因子TNF-α、IL-6高水平表達(dá)。說明內(nèi)毒素休克后器官擴(kuò)散的炎癥反應(yīng)是LPS及LBP／CD14增加LPS作用的共同結(jié)果。當(dāng)給予小劑量正常小鼠腸淋巴液后，內(nèi)毒素休克小鼠肺組織和心肌組織的LBP和CD14水平顯著降低，肺組織炎癥因子TNF-α及心肌組織TNF-α、IL-6水平也同步下降。由此表明，正常淋巴液減輕肺、心肌組織損傷的機(jī)制可能與其降低內(nèi)毒素增敏系統(tǒng)的作用有關(guān)。

本實驗結(jié)果還顯示，輸入正常淋巴液在降低肝組織炎癥因子TNF-α與IL-6水平的同時，并未引起肝組織LBP／CD14水平的下降，這提示正常淋巴液減輕內(nèi)毒素休克肝損傷的作用可能與內(nèi)毒素增敏系統(tǒng)無關(guān)，其作用可能是通過其它途徑實現(xiàn)的，如通過提高肝組織血液灌注量［7］、降低白細(xì)胞黏附［8］、降低自由基損傷［9］等，也可能存在其它未明了的機(jī)制。

綜上所述，在腹腔注射LPS導(dǎo)致內(nèi)毒素休克引起的器官損傷過程中，內(nèi)毒素致敏系統(tǒng)LBP／CD14發(fā)揮著重要的作用；正常腸淋巴液可降低內(nèi)毒素休克小鼠肺、心肌組織炎癥反應(yīng)可能通過下調(diào)內(nèi)毒素增敏系統(tǒng)LBP／CD14來實現(xiàn)，表明以正常腸淋巴液作為藥物靶點(diǎn)，對于防治內(nèi)毒素休克引起的器官損傷具有一定的參考價值及指導(dǎo)意義。

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