丹參滴注液清潔驗(yàn)證檢驗(yàn)方法的確認(rèn)研究

夏蘊(yùn)瓊

(上海華源安徽錦輝制藥有限公司，安徽阜陽(yáng) 236018)

丹參具有袪瘀止痛、活血通經(jīng)、清心除煩的作用，主治冠心病、心絞痛、心煩不眠、月經(jīng)不調(diào)、閉經(jīng)、痛經(jīng)等癥［1］。其化學(xué)成分主要為脂溶性的二萜類成分和水溶性的酚酸類成分［2］。水溶性化合物主要有丹參素(Danshensu)、原兒茶醛(Procatechualdehyde)、丹酚酸(Salvianolic acid)［3］等。丹參水溶性成分檢測(cè)采用HPLC法，指標(biāo)性成分主要是丹參素鈉、原兒茶醛和丹酚酸B等［4-7］。本實(shí)驗(yàn)是對(duì)丹參滴注液清潔驗(yàn)證殘留活性成分的檢驗(yàn)方法進(jìn)行確認(rèn)。同時(shí)對(duì)丹參滴注液清潔驗(yàn)證的取樣回收率進(jìn)行確認(rèn)。

1 設(shè)備、材料和試劑

1.1 設(shè)備 車間生產(chǎn)所使用的設(shè)備按照與產(chǎn)品接觸的情況，可分為三類:直接接觸產(chǎn)品的設(shè)備(濃配罐、稀配罐、配液系統(tǒng)循環(huán)管路、灌裝機(jī)貯液罐);非接觸產(chǎn)品的設(shè)備(濃配罐外表面、稀配罐外表面、配液系統(tǒng)循環(huán)管路外表面、灌裝機(jī)外表面、加塞機(jī)外表面);非直接接觸產(chǎn)品的設(shè)備(振動(dòng)理塞斗、理塞軌道、加塞桿)。

1.2 檢驗(yàn)儀器與試藥 檢驗(yàn)儀器:安捷倫1260高效液相色譜儀(G1311C四元泵，G1314F VWD紫外檢測(cè)器，G1329B ALS自動(dòng)進(jìn)樣器，安捷倫液相色譜系統(tǒng)工作站);電子分析天平AE240(梅特勒)。

試藥:丹參素鈉對(duì)照品，購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司;原兒茶醛對(duì)照品，購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所;甲醇(色譜純)、冰醋酸(分析純)購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

2 方法

2.1 清潔設(shè)備的確認(rèn) 清潔驗(yàn)證對(duì)象:直接接觸產(chǎn)品的設(shè)備。設(shè)備清潔方式:在線清潔、手動(dòng)清潔。所用清潔劑:注射用水、1%氫氧化鈉溶液、1%枸櫞酸溶液。

2.2 配液系統(tǒng)及灌裝機(jī)清潔方法的確認(rèn)

2.2.1 預(yù)洗 濃配系統(tǒng):經(jīng)清洗球淋洗濃配罐內(nèi)壁循環(huán)5 min后，通過(guò)罐底排污閥門(mén)排盡淋洗液。

稀配系統(tǒng)及罐裝機(jī)組:開(kāi)啟循環(huán)泵，經(jīng)稀配管路、鈦棒過(guò)濾器、折疊濾芯過(guò)濾器、灌封管道循環(huán)5 min后，經(jīng)終端過(guò)濾器、儲(chǔ)液缸灌封機(jī)36個(gè)灌裝工位排盡淋洗液。

2.2.2 清洗 于濃配罐中注入1%氫氧化鈉溶液，開(kāi)啟循環(huán)泵經(jīng)循環(huán)管路及清洗球淋洗濃配罐10 min后，泵入稀配罐，開(kāi)啟循環(huán)泵，使1%氫氧化鈉溶液經(jīng)稀配管路、鈦棒過(guò)濾器、折疊濾芯過(guò)濾器、灌封管道循環(huán)10 min后，經(jīng)終端過(guò)濾器、儲(chǔ)液缸，灌封機(jī)36個(gè)灌裝工位排盡，再打開(kāi)各排污閥，排盡罐內(nèi)、鈦棒過(guò)濾器、折疊過(guò)濾器中的1%氫氧化鈉溶液;再于濃配罐中注入5 kg枸櫞酸，配制成1%枸櫞酸溶液，開(kāi)啟循環(huán)泵經(jīng)循環(huán)管路及清洗球淋洗濃配罐10 min后，泵入稀配罐;開(kāi)啟稀配循環(huán)泵，使1%枸櫞酸溶液經(jīng)稀配管路、鈦棒過(guò)濾器、折疊濾芯過(guò)濾器、灌封管道循環(huán)10 min后，經(jīng)終端過(guò)濾器、儲(chǔ)液缸、灌封機(jī)36個(gè)灌裝工位排盡，再打開(kāi)各排污閥，排盡罐內(nèi)、鈦棒過(guò)濾器、折疊過(guò)濾器中的1%枸櫞酸溶液;酸堿沖洗結(jié)束后，注入注射用水于濃配罐中，開(kāi)啟循環(huán)泵經(jīng)循環(huán)管路及清洗球淋洗濃配罐10 min后，打開(kāi)濃配罐和砂棒過(guò)濾器底部的排污隔膜閥，再打開(kāi)排污閥，排盡罐內(nèi)及砂棒過(guò)濾器中的注射用水;注入注射用水于濃配罐中開(kāi)啟循環(huán)泵，使注射用水經(jīng)清洗球淋洗濃配管路循環(huán)10 min后，泵入稀配罐，開(kāi)啟循環(huán)泵，讓注射用水溶液經(jīng)稀配管路、鈦棒過(guò)濾器、折疊濾芯過(guò)濾器、灌封管道環(huán)10 min，經(jīng)終端過(guò)濾器、儲(chǔ)液缸循后，灌封機(jī)36個(gè)灌裝工位排盡，再打開(kāi)各排污閥，排盡罐內(nèi)、鈦棒過(guò)濾器、折疊過(guò)濾器中的注射用水，此操作共3遍。配液管路系統(tǒng)和灌封機(jī)組的清潔有效期為10 h。

2.3 色譜條件 用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，甲醇—0.5%冰醋酸溶液(5∶95)為流動(dòng)相，流速1.0 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)為281 nm，理論板數(shù)按丹參素鈉峰計(jì)算應(yīng)不低于5 000。

2.4 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取含量為98.0%的丹參素鈉對(duì)照品14.21 mg置100 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取20 mL置50 mL量瓶中，加水至刻度，搖勻。得丹參素鈉濃度為55.7 mg·L-1的對(duì)照品溶液。

精密稱取原兒茶醛對(duì)照品10.76 mg置100 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取5 mL置100 mL量瓶中，加水至刻度，搖勻。得濃度5.38 mg·L-1的對(duì)照品溶液。

3 清潔驗(yàn)證檢驗(yàn)方法與結(jié)果

3.1 線性關(guān)系考察 分別取2.4項(xiàng)下丹參素鈉、原兒茶醛對(duì)照品貯備液1、2、3、4、5 mL 置 10 mL 量瓶中，分別加水稀釋至刻度，搖勻，作為供試液。精密量取供試液各20 μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，記錄峰面積，由溶液濃度(C)對(duì)峰面積(A)線性回歸，得回歸方程:A=13.426C-1.655，r=0.999 9，A=83.203C-0.306 6，r=0.999 9。

3.2 檢測(cè)限 取空白基線一段，計(jì)算其噪音峰高，再將丹參素鈉對(duì)照品溶液(濃度為55.70 mg·L-1)、原兒茶醛對(duì)照品溶液(濃度為5.38 mg·L-1)用水稀釋到適當(dāng)?shù)臐舛冗M(jìn)樣，使其峰高為噪音峰高的3倍，經(jīng)試驗(yàn)，此時(shí)的進(jìn)樣濃度為27.85、5.38 μg·L-1，即最低檢出量為 0.6、0.1 ng。

3.3 精密度試驗(yàn) 取丹參素鈉對(duì)照品溶液、原兒茶醛對(duì)照品溶液，對(duì)低(5.57、0.538 mg·L-1)、中(16.71、1.614 mg·L-1)、高(55.70、2.690 mg·L-1)濃度的樣品溶液均分別平行測(cè)定了5次，以峰面積來(lái)考察精密度，計(jì)算低、中、高濃度組RSD分別為0.1% 、0.9%，0.1%、0.3%，0.1%、0.3%。表明儀器的精密度很好。

3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品分別制成6份供試液，按含量測(cè)定的方法測(cè)定含量。結(jié)果丹參素鈉、原兒茶醛含量的平均值為8.86、1.94 mg·L-1，RSD為0.3%、1.2%。

3.5 準(zhǔn)確度試驗(yàn) 取已知丹參素鈉含量為442.80 mg·L-1、原兒茶醛含量為94.86 mg·L-1的丹參滴注液樣品1份，加入9份濃度約為55.70 mg·L-1的丹參素鈉對(duì)照品溶液、濃度約為5.38 mg·L-1的原兒茶醛對(duì)照品溶液，分別混合均勻作為供試液，按丹參滴注液成品中丹參素鈉含量檢驗(yàn)方法檢驗(yàn)，取此供試液進(jìn)樣2次。制備兩份供試液，檢測(cè)丹參素鈉、原兒茶醛的含量分別為94.60、14.29、94.43、14.36 mg·L-1，平均回收率為100.21%、99.94%。

3.6 樣品的檢測(cè) 丹參素鈉對(duì)照品溶液的制備:精密稱取丹參素鈉對(duì)照品(含量98.0%)0.012 16 g，置100 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，從中精密量取2 mL置25 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得每1 mL中含丹參素鈉為9.53 μg的對(duì)照品溶液。

原兒茶醛對(duì)照品溶液的制備:精密稱取原兒茶醛對(duì)照品0.013 84 g，置100 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，從中精密量取5 mL置100 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得每1mL中含原兒茶醛6.92 μg的對(duì)照品溶液。

表1 清潔水中丹參素鈉和原兒茶醛的含量

測(cè)定法:分別精密吸取上述兩種對(duì)照品溶液與清潔水各20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算，即得。

按上述色譜條件測(cè)定方法，測(cè)定了清潔水中丹參素鈉和原兒茶醛的含量，結(jié)果見(jiàn)表1。

3.7 擦拭取樣方法及取樣回收率 棉簽擦拭取樣:取三塊與設(shè)備類似的潔凈的316L不銹鋼板，分別在鋼板上劃出5 cm×5 cm的區(qū)域，用移液管精密量取丹參素鈉、原兒茶醛對(duì)照品溶液(濃度約為100 mg·L-1)1 mL，將其盡量均勻地涂布在5 cm×5 cm區(qū)域內(nèi)，晾干。取一支潔凈的棉簽，用注射用水充分潤(rùn)濕，握住棉簽柄，以30°角與取樣表面接觸，用力使其稍彎曲，呈Z字形平穩(wěn)而緩慢的擦拭取樣表面。在向前移動(dòng)的同時(shí)將其翻轉(zhuǎn)從一邊移到另一邊，擦拭過(guò)程應(yīng)覆蓋整個(gè)表面，翻轉(zhuǎn)棉簽，讓另一面也進(jìn)行擦拭，但與前次擦拭移動(dòng)方向垂直，如圖1所示。

擦拭完成后，將棉簽頭剪下放入潔凈瓶中，往瓶中精密加入25 mL注射用水，超聲15 min，取此溶液為供試液，按丹參滴注液成品中丹參素鈉、原兒茶醛含量檢驗(yàn)方法檢測(cè)丹參素鈉、原兒茶醛的含量。計(jì)算回收率，丹參素鈉及原兒茶醛的取樣回收率均不得低于80%。

圖1 擦拭示意圖

4 討論

丹參滴注液為靜脈滴注，生產(chǎn)結(jié)束后清潔劑為1%氫氧化鈉溶液、1%枸櫞酸溶液和注射用水，清潔后殘留物限度≤10 mg·L-1［8-11］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該清潔方法能夠滿足丹參滴注液生產(chǎn)結(jié)束后的清潔要求，該實(shí)驗(yàn)條件能夠滿足丹參滴注液清潔驗(yàn)證殘留物檢測(cè);結(jié)合TOC和電導(dǎo)率的檢測(cè)，能夠準(zhǔn)確有效的判斷丹參滴注液清潔驗(yàn)證的有效性、可靠性、重現(xiàn)性。

［1］ 秦小強(qiáng).對(duì)中國(guó)2010版《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》中清潔驗(yàn)證的分析［J］.中國(guó)醫(yī)藥指南，2013，11(23):447-448.

［2］ 劉 杰.關(guān)于制藥設(shè)備清潔驗(yàn)證中表面微生物擦拭取樣方法和檢驗(yàn)方法的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)［J］.當(dāng)代化工，2012，41(10):1009-1011，1013.

［3］ 辛寶洪，劉 敬，蘇恩廣.淺析制藥設(shè)備的清潔驗(yàn)證［J］.醫(yī)藥前沿，2012，2(18):7.

［4］ 楊素改，張學(xué)菊.非無(wú)菌原料藥生產(chǎn)設(shè)備的清潔驗(yàn)證［J］.中國(guó)當(dāng)代醫(yī)藥，2013，20(4):156-157.

［5］ 楊武勝，馬春香.淺析制藥設(shè)備清潔驗(yàn)證［J］.黑龍江科技信息，2012(6):3.

［6］ 彭 菲，葉正良，楊亞寧，等.對(duì)中藥注射劑生產(chǎn)設(shè)備清潔驗(yàn)證的探討［J］.中國(guó)藥事，2012，26(10):1132-1135.

［7］ 路 線，邵 超，闞家義.地塞米松磷酸鈉注射液檢驗(yàn)方法研究［J］.黑龍江醫(yī)藥，2012，25(1):30-31.

［8］ 周 銳，于紹東.淺談制藥企業(yè)工藝設(shè)備清潔驗(yàn)證［J］.黑龍江科技信息，2013(1):15.

［9］ 管玉華，徐春明.藥品清潔驗(yàn)證中殘留物檢測(cè)的分析方法選擇［J］.中國(guó)醫(yī)療前沿，2013，8(22):92，96.

［10］柳 楠，劉成旭.對(duì)中藥注射劑生產(chǎn)設(shè)備清潔驗(yàn)證的探討［J］.黑龍江科技信息，2013(18):70.

［11］汪躍峰，劉勁松，鐘文武，等.高效液相色譜法測(cè)定馬蘭中大黃素的含量［J］.安徽醫(yī)藥，2013，17(3):393-394.