東祁連山高寒草地土壤產(chǎn)漆酶真菌的篩選、鑒定及產(chǎn)酶條件的初步研究

蘆光新，王軍邦， 陳秀蓉，楊成德，薛莉

(1.青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院草業(yè)科學(xué)系，青海 西寧 810016；2.中國(guó)科學(xué)院地理科學(xué)與資源研究所，北京 100094；3.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院 草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州 730070)

漆酶(Laccase EC 1.10.3.2)，即對(duì)苯二酚，又名酚酶，多酚氧化酶等[1]。就結(jié)構(gòu)而言，漆酶是一種含銅的糖蛋白氧化酶，也稱為多銅氧化酶；就屬性而言，它和植物中的抗壞血酸氧化酶、哺乳動(dòng)物的血漿銅藍(lán)蛋白同屬藍(lán)色多銅氧化酶(blue multi-copper oxidase)家族[2]；就功能而言，漆酶是木質(zhì)素降解酶之一，與木質(zhì)素過(guò)氧化物酶(lignin peroxidase，LiP)和錳過(guò)氧化物酶(manganese dependent peroxidase，MnP)共同構(gòu)成木質(zhì)素降解酶系[3]。

漆酶作為生物代謝產(chǎn)物，在生物體內(nèi)參與應(yīng)激防御反應(yīng)、細(xì)胞壁重建、形態(tài)發(fā)生、與宿主相互作用、腐殖質(zhì)的代謝更新等生物學(xué)功能；在體外漆酶可催化多種酚類和芳香胺類化合物的氧化，降解多環(huán)芳烴[4]。漆酶氧化木質(zhì)素中的酚型單元形成苯氧自由基，從而導(dǎo)致木質(zhì)素相關(guān)結(jié)構(gòu)的降解和轉(zhuǎn)化，在合適的氧化還原介體存在時(shí)，漆酶還可催化氧化非酚型的木質(zhì)素模型化合物[5-7]?？梢?jiàn)，漆酶在木質(zhì)素的生物降解有重要應(yīng)用前景。除此之外，漆酶被廣泛應(yīng)用于工業(yè)氧化處理過(guò)程中，例如各類漂白、生物去污、乙醇生產(chǎn)、生物傳感器、生物燃料電池等[8]，在食品工業(yè)、制漿和造紙工業(yè)、紡織工業(yè)、土壤的生物修復(fù)等領(lǐng)域，備受研究者和生產(chǎn)加工者的關(guān)注[9]。但是，由于天然來(lái)源的生物漆酶產(chǎn)量低、價(jià)格昂貴，很難滿足市場(chǎng)需求，漆酶的規(guī)模化和產(chǎn)業(yè)化相應(yīng)受到限制，因此，尋求產(chǎn)漆酶的生物資源是擺在人們面前亟待解決的問(wèn)題。

已有的研究證實(shí)，漆酶存在于植物、微生物、動(dòng)物、昆蟲的質(zhì)體的各種器官或組織中。漆酶由Yoshi[10]首次在紫膠漆樹(Rhusverniciflua)的滲出液中發(fā)現(xiàn)的, 隨后人們發(fā)現(xiàn)微生物(真菌、細(xì)菌)、動(dòng)物、昆蟲也能分泌這種酶。植物來(lái)源漆酶主要出現(xiàn)在植物木質(zhì)部，葉子、根中也有，植物漆酶主要參與愈傷組織形成、木質(zhì)化等過(guò)程[11]。動(dòng)物體中發(fā)現(xiàn)的漆酶很少，報(bào)道的有豬腎和麻蠅(Phormiacegina、Muscadomestica、Luciliasericata)、煙草天蛾(Manducasexta)、綠頭蒼蠅(Calliphoravicina)、蚊子和雙翅目的遷移類蝗蟲等[12-14]。相對(duì)于植物和動(dòng)物來(lái)講，微生物漆酶來(lái)源相對(duì)豐富，主要分為真菌來(lái)源和細(xì)菌來(lái)源,已知在多種真菌菌株分泌物中都檢測(cè)到了漆酶的活性[15], 值得一提的是，真菌產(chǎn)漆酶具有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)：1)真菌分泌的漆酶都是胞外酶，使得漆酶的分離純化相比胞內(nèi)酶而言稍顯容易，而且在胞外的穩(wěn)定性也較好；2)產(chǎn)酶效率高, 產(chǎn)生漆酶酶系結(jié)構(gòu)較合理, 相互間可發(fā)生強(qiáng)烈的協(xié)同作用; 3)可同時(shí)產(chǎn)生許多纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶、淀粉酶等，這些酶的協(xié)同效應(yīng)對(duì)降解木質(zhì)素具有重要的意義。因此，真菌漆酶的研究備受矚目，成為研究的熱點(diǎn)[16]。

由于漆酶巨大的應(yīng)用價(jià)值, 因此進(jìn)行漆酶產(chǎn)生菌的分離篩選一直是漆酶研究的熱點(diǎn)之一。到目前為止，已有從土壤中分離篩選產(chǎn)漆酶真菌的報(bào)道[17-20]，但高寒草地土壤中產(chǎn)漆酶菌株的篩選鮮有報(bào)道。研究發(fā)現(xiàn)，東祁連山高寒草地土壤微生物多樣性較為豐富[21]，并且草地生態(tài)系統(tǒng)土壤微生物與其生態(tài)環(huán)境協(xié)同進(jìn)化, 形成的一種適應(yīng)性機(jī)制[22]。以高寒草地土壤分離出的56個(gè)真菌菌株為研究對(duì)象，選用與漆酶作用的幾種底物為選擇性培養(yǎng)基，并通過(guò)測(cè)定漆酶活力，篩選高寒草地土壤中的產(chǎn)漆酶菌株，并對(duì)篩選出的產(chǎn)漆酶菌株進(jìn)行了產(chǎn)酶條件的研究，旨在為進(jìn)一步工業(yè)化的開發(fā)和應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試的56個(gè)真菌菌株由本課題組從東祁連山高寒草地土壤中分離篩選獲得，保存于4℃冰箱。實(shí)驗(yàn)時(shí)間為2012年2-5月。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1菌株活化、保存培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15 g，蒸餾水1000 mL，pH自然，用于菌株的活化、復(fù)壯。

1.2.2產(chǎn)漆酶菌株篩選培養(yǎng)基 愈創(chuàng)木酚-PDA培養(yǎng)基：PDA 培養(yǎng)基滅菌后添加經(jīng)無(wú)菌過(guò)濾器除菌的愈創(chuàng)木酚-乙醇溶液, 使愈創(chuàng)木酚的最終濃度為3 mmol/L。

α-萘酚-PDA培養(yǎng)基：以α-萘酚替代愈創(chuàng)木酚。

愈創(chuàng)木酚為底物的選擇性培養(yǎng)基：NaNO32 g，K2HPO41 g，KCl 0.5 g，MgSO40.5 g，F(xiàn)eSO40.01 g，愈創(chuàng)木酚 10 g，瓊脂 10 g，蒸餾水1000 mL。pH用稀鹽酸調(diào)制6.0～7.0。

鄰苯二酚為底物的選擇性培養(yǎng)基：NaNO32 g，K2HPO41 g，KCl 0.5 g，MgSO40.5 g，F(xiàn)eSO40.01 g，鄰苯二酚 10 g，瓊脂 10 g，蒸餾水1000 mL。pH用稀鹽酸調(diào)制6.0～7.0。

鄰苯甲苯胺為底物的選擇性培養(yǎng)基：NaNO32 g，K2HPO41 g，KCl 0.5 g，MgSO40.5 g，F(xiàn)eSO40.01 g，鄰苯甲苯胺 10 g，瓊脂 10 g，蒸餾水1000 mL。pH用稀鹽酸調(diào)制6.0～7.0。

1.2.3液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基 NaNO32.5 g，KH2PO41 g，CaCl2·6H2O 0.1 g，MgSO40.3 g，NaCl 0.1 g，F(xiàn)eCl30.01 g，油菜秸稈粉0.5 g，蒸餾水1000 mL，pH用稀鹽酸調(diào)制6.0～7.0。

1.3 研究方法

1.3.1產(chǎn)漆酶真菌的初步篩選 將活化的菌株接種于愈創(chuàng)木酚-PDA培養(yǎng)基和α-萘酚-PDA培養(yǎng)基, 25℃培養(yǎng)，定時(shí)觀察菌落生長(zhǎng)和菌落周圍顏色深淺變化情況。選出能在愈創(chuàng)木酚-PDA培養(yǎng)基和α-萘酚-PDA培養(yǎng)基產(chǎn)生褐色氧化帶的陽(yáng)性菌株，分別接種于以愈創(chuàng)木酚、鄰苯二酚、鄰苯甲苯胺為唯一碳源的選擇性培養(yǎng)基，25℃培養(yǎng)，每天定時(shí)觀察菌落形態(tài)的同時(shí), 測(cè)量菌落直徑、褐色氧化帶變色圈的直徑, 記錄變色圈顏色深淺，以此作為定性指標(biāo)，判斷菌株產(chǎn)漆酶的情況。

1.3.2粗酶液的制備及漆酶活力測(cè)定 將篩選出的菌株接種于已滅菌的盛有50 mL發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基的150 mL錐形瓶中，以油菜秸稈粉為底物，不接菌為對(duì)照，于25℃，150 r/min震蕩培養(yǎng)7～10 d，每個(gè)處理重復(fù)3次。培養(yǎng)結(jié)束后，在無(wú)菌操作的條件下，吸取5 mL上清液，于4℃，10000 r/min，離心10 min，取上清液制備粗酶液。

酶活力測(cè)定方法，以愈創(chuàng)木酚為漆酶底物，按照王劍鋒等[23]的方法進(jìn)行測(cè)定，1個(gè)酶活單位(IU)定義為1 min內(nèi)氧化1 μmol 愈創(chuàng)木酚所需要的酶量。

1.3.3rDNA-ITS分子鑒定 真菌rDNA-ITS的分子鑒定方法參考相關(guān)文獻(xiàn)[24]。

1.3.4產(chǎn)酶條件的研究 應(yīng)用搖瓶液體發(fā)酵的方法，以油菜秸稈粉為底物，分別在不同培養(yǎng)條件下，測(cè)定漆酶酶活力。

1.4 數(shù)據(jù)處理及分析

所有數(shù)據(jù)均用Microsoft Excel 錄入并作圖，采用DPS 6.55進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)漆酶菌株的初步篩選結(jié)果

從56個(gè)供試菌株在α-萘酚-PDA培養(yǎng)基和愈創(chuàng)木酚-PDA培養(yǎng)基上的培養(yǎng)結(jié)果來(lái)看，菌株編號(hào)為1.9、2.1a、310b、301g、2.1c、3.7c、無(wú)孢、2.3a、2.4d、10a、H-待定、W-QLZ14等菌株能夠在愈創(chuàng)木酚-PDA培養(yǎng)基上產(chǎn)生褐色的氧化帶，菌株編號(hào)為1.9、2.1a、310b、301g、2.3a、2.4d、10a、H-待定、W-QLZ14等菌株能夠在α-萘酚-PDA培養(yǎng)基上產(chǎn)生褐色的氧化帶。

2.2 供試菌株在α-萘酚-PDA和愈創(chuàng)木酚-PDA篩選培養(yǎng)基上出現(xiàn)褐色氧化帶的時(shí)序

由表1可以看出，在α-萘酚-PDA培養(yǎng)基上，接種后24 h，菌株1.9、2.1a、310b、W-QLZ14周圍出現(xiàn)褐色氧化帶，接種后48 h，菌株 H-待定周圍出現(xiàn)褐色氧化帶，接種72 h后，菌株301g、2.1c、2.3a、2.4d周圍出現(xiàn)褐色氧化帶。在愈創(chuàng)木酚-PDA培養(yǎng)基上，接種后24 h，菌株1.9、2.1a、310b、2.1c、2.3a、H-待定、W-QLZ14周圍出現(xiàn)褐色氧化帶，接種48 h后，菌株301g、2.4d、10a周圍出現(xiàn)褐色氧化帶，接種72 h后，菌株3.7c和無(wú)孢周圍出現(xiàn)褐色氧化帶。由此可見(jiàn)，不同菌株在不同底物作為誘導(dǎo)劑的培養(yǎng)基上出現(xiàn)褐色氧化帶的時(shí)間不同，有的菌株產(chǎn)酶較早，有的菌株產(chǎn)酶較晚。另外，菌株3.7c、無(wú)孢和10a能在GUA+PDA培養(yǎng)基上產(chǎn)生褐色氧化帶，而不在α-萘酚+PDA培養(yǎng)基上產(chǎn)生褐色氧化帶。

2.3 供試菌株在3種篩選培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況及褐色氧化帶

將篩選出的菌株，分別接種于以愈創(chuàng)木酚、鄰苯二酚、鄰苯甲苯胺為底物的選擇性培養(yǎng)基上，由圖1可以看出，11個(gè)菌株在3種底物的培養(yǎng)基上的菌落直徑以及出現(xiàn)褐色氧化帶直徑不同，并且褐色氧化帶顏色的深淺程度也不同。

表1 供試菌株在α-萘酚PDA培養(yǎng)基和愈創(chuàng)木酚-PDA培養(yǎng)基出現(xiàn)褐色氧化帶的時(shí)序Table 1 The appear timing of brown oxidation zone of strains on the α-naphthol PDA medium and GUA-PDA medium

注：+表示出現(xiàn)褐色氧化帶。

Note：“+” indicates the emergence of brown oxidation zone.

圖1 供試菌株在3種選擇性培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況及出現(xiàn)的氧化帶Fig.1 The growth status and emergence brown oxidation zone of strains on three different selective mediumA:愈創(chuàng)木酚培養(yǎng)基Guaiacol selective medium；B:鄰苯二酚培養(yǎng)基Catechol selective medium；C:鄰甲苯胺培養(yǎng)基O-toluidine selective medium.

表2 供試菌株在選擇性培養(yǎng)基上的菌落直徑和氧化帶直徑Table 2 Colony diameter and oxidation zone diameter of strains on three different selective mediumcm

注：表中列出的氧化帶直徑一欄中，前面的數(shù)字表示氧化帶直徑, 括號(hào)中的“+” 表示顏色的深淺程度，“-”表示沒(méi)有產(chǎn)生氧化帶；菌落直徑一欄中，括號(hào)中的“+”表示能生長(zhǎng)，“-”表示不能生長(zhǎng)，數(shù)字表示菌落直徑大小。

Note：The table lists the oxidation zone and colony diameter，the previous number indicates oxidation zone diameter in the column of oxidation zone，“+” indicates color depth，“-” indicates there did not produce the oxidation zone in the brackets；In the column of colony diameter，“+” indicates strains can grow on the medium，“-” indicates strains did not grow，the previous number indicates colony diameter.

由表2可以看出，在愈創(chuàng)木酚培養(yǎng)基上，除Fsp9和H-待定2個(gè)菌株不能生長(zhǎng)之外，其余9個(gè)菌株均能生長(zhǎng)，并且產(chǎn)生褐色氧化帶，1.9、310b、2.3a、2.4d 4個(gè)菌株的菌落直徑較大，褐色氧化帶直徑較大，氧化帶的顏色較深。在鄰苯二酚培養(yǎng)基上，1.9、310b、301g、2.1c、2.1a、W-QLZ14 6個(gè)菌株能夠生長(zhǎng)，并且產(chǎn)生褐色氧化帶，310b和2.1a的褐色氧化帶直徑較小，而1.9、301g、2.1c、W-QLZ14褐色氧化帶直徑較大。在鄰苯甲苯胺培養(yǎng)基上，菌株2.3a不能生長(zhǎng)外，其余10個(gè)菌株均能生長(zhǎng)。310b、2.4d、10a 3個(gè)菌株產(chǎn)生褐色氧化帶的直徑大，顏色較深，菌株301g和H-待定產(chǎn)生的褐色氧化帶的顏色較淺。

2.4 產(chǎn)漆酶酶活菌株的復(fù)選結(jié)果

測(cè)定漆酶酶活力的結(jié)果表明，以油菜秸稈為底物，液體搖瓶發(fā)酵后，只有菌株310b能夠產(chǎn)生漆酶，其余菌株檢測(cè)不到漆酶酶活。

2.5 產(chǎn)漆酶菌株的分子鑒定結(jié)果

將該序列在GenBank 中進(jìn)行BLAST同源性比較，發(fā)現(xiàn)與GenBank中報(bào)道的1株Marasmiustricolor(登錄號(hào)：JN943601)同源性達(dá)到99%以上。為了進(jìn)一步確定目標(biāo)菌株的分類地位，采用Neighbor-Joining 法(圖2A)和UPGMA 法(圖2B)分別構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果顯示，菌株310b在2種系統(tǒng)發(fā)育樹中的結(jié)果一致，即與登錄號(hào)為JN943601的菌株的親緣關(guān)系最近，支持率高達(dá)99%～100%。通過(guò)rDNA-ITS 序列分析，菌株310b初步鑒定為Marasmiustricolor。

圖2 菌株310b系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建Fig.2 Construction of phylogenetic tree of strain 310b A、B分別為基于Neighbor-Joining法和UPGMA法的系統(tǒng)發(fā)育樹。A, B is phylogenetic tree based on Neighbor-Joining method and the UPGMA method respectively.

2.6 產(chǎn)漆酶條件的研究結(jié)果

2.6.1溫度對(duì)菌株310b產(chǎn)漆酶的影響 菌株310b在15～35℃范圍內(nèi)可以產(chǎn)漆酶，15～25℃隨溫度上升，漆酶活力增加，25℃時(shí)產(chǎn)漆酶活力最大，且差異極顯著(P<0.01)，25～35℃范圍內(nèi)，隨溫度上升，漆酶活力減少；在20～28℃范圍內(nèi)產(chǎn)酶活力達(dá)80%以上(圖3)。

2.6.2初始pH值對(duì)菌株310b產(chǎn)漆酶的影響 初始pH值對(duì)菌株310b產(chǎn)漆酶活力有影響，較小的pH值有利于產(chǎn)酶，pH=4.0時(shí)漆酶活力最大，且差異極顯著(P<0.01)，之后隨pH的增加，產(chǎn)漆酶活力呈下降趨勢(shì)，但pH值在5.0～9.0范圍內(nèi)，漆酶活力下降幅度不大(圖4)。我們推測(cè)，菌株310b分泌的漆酶有可能是一種偏酸性酶。

圖3 溫度對(duì)310b 產(chǎn)漆酶的影響Fig.3 The effect of temperature on laccase

圖4 pH對(duì)310b 產(chǎn)漆酶的影響Fig.4 The effect of pH value on laccase

2.6.3C源對(duì)菌株310b產(chǎn)漆酶的影響 以油菜秸稈粉作為唯一的碳源，分別添加葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉、糊精、D-半乳糖、D-木糖、D-果糖、羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)進(jìn)行搖瓶液體發(fā)酵, 由圖5可以看出，不同碳源誘導(dǎo)菌株310b產(chǎn)漆酶活力不同，其中添加蔗糖可以促進(jìn)菌株310b分泌漆酶，但差異不顯著，而添加其他碳源會(huì)抑制菌株310b產(chǎn)漆酶的活力(圖5)。

2.6.4N源對(duì)菌株310b產(chǎn)漆酶的影響 不同氮源對(duì)菌株310b產(chǎn)漆酶水平的影響結(jié)果如圖6，可以看出分別以硫酸銨、酒石酸銨、硝酸鈉、磷酸銨、蛋白胨、L-酪氨酸、DL-苯丙氨酸、L-賴氨酸、尿素作為不同氮源誘導(dǎo)菌株310b產(chǎn)漆酶活力不同，9種氮源中，蛋白胨最有利于菌株310b分泌漆酶，誘導(dǎo)漆酶活力最高，其次為L(zhǎng)-酪氨酸和L-苯丙氨酸，尿素誘導(dǎo)產(chǎn)漆酶活力最低。

圖5 C源對(duì)3.10b產(chǎn)漆酶的影響Fig.5 The effect of C-source on laccase

A:葡萄糖Glucose;B:蔗糖Saccharose;C:麥芽糖Maltose;D:可溶性淀粉Soluble starch;E:糊精Dextrin;F:D-半乳糖 D-galactose;G:D-木糖 D-xylose;H:D-果糖 D-fructose;I:羧甲基纖維素鈉CMC-Na;J:油菜秸稈粉Rape straw powder.

圖6 N源對(duì)3.10b產(chǎn)漆酶的影響 Fig.6 The effect of N-source on laccase laccase

A:硫酸銨Ammonium sulfate;B:酒石酸銨Ammonium tartrate;C:硝酸鈉Sodium nitrate;D:磷酸銨Ammonium phosphate;E:蛋白胨 Peptone;F:L-酪氨酸 L-tyrosine;G:DL-苯丙氨酸DL-phenylalanine;H:L-賴氨酸 L-lysine;I:尿素Urea.

圖7 非營(yíng)養(yǎng)有機(jī)物對(duì)310b產(chǎn)漆酶的影響Fig.7 The effect of non nutrient organic on laccase A:吲哚乙酸 Indoleacetic acid;B:鄰甲苯胺 O-Tolidine;C:鄰苯二酚 Catechol;D:α-萘酚α-naphthol;E:單寧酸 Tannin;F:愈創(chuàng)木酚 Guaiacol;G:吐溫-80 Tween 80;H:對(duì)照CK.

2.6.5非營(yíng)養(yǎng)有機(jī)物對(duì)菌株3.10b產(chǎn)漆酶的影響 分別在產(chǎn)酶培養(yǎng)基中添加1%的吲哚乙酸(In-doleacetic acid)、愈創(chuàng)木酚(Guaiacol)、鄰甲苯胺(O-Tolidine)、鄰苯二酚(Catechol)、α-萘酚(α-naphthol)、單寧酸(Tannin)、吐溫-80(Tween 80)，考察它們對(duì)菌株310b漆酶合成的影響，結(jié)果表明,鄰甲苯胺、α-萘酚和吐溫-80促進(jìn)菌株310b漆酶的合成；愈創(chuàng)木酚、鄰苯二酚、單寧酸、吲哚乙酸抑制菌株產(chǎn)酶，其中吲哚乙酸抑制作用最強(qiáng)烈(P<0.01)(圖7)。

2.6.6Cu2+對(duì)菌株310b產(chǎn)漆酶的影響 在產(chǎn)酶培養(yǎng)基中添加一定量的CuSO4·5H2O，均有利于菌株產(chǎn)酶。結(jié)果顯示，培養(yǎng)基中添加CuSO4·5H2O，在0.001～0.025 g/L范圍內(nèi)，隨Cu2+增加，產(chǎn)漆酶活力增加，0.025 g/L時(shí)產(chǎn)酶活力最大(圖8)。

2.6.7接種量對(duì)菌株310b產(chǎn)漆酶的影響 不同接種量對(duì)菌株310b產(chǎn)漆酶活力不同，隨著接種量的增加，誘導(dǎo)漆酶活力增加(圖9)。圖9中，S1～S5分別表示不同的接種量，以在PDA平板上將培養(yǎng)7～10 d的供試菌用6 mm直徑的打孔器切取1個(gè)菌餅(6 mm)為標(biāo)準(zhǔn)，按1，2，3，4，5個(gè)菌餅分別接種處理。

圖8 Cu2+對(duì)310b產(chǎn)漆酶的影響Fig.8 The effect of Cu2+ on laccase

圖9 接種量對(duì)310b產(chǎn)漆酶的影響Fig.9 The effect of incolum size on laccase

圖10 轉(zhuǎn)速對(duì)310b產(chǎn)漆酶的影響Fig.10 The effect of rotation speed on laccase

圖11 天然碳源對(duì)310b產(chǎn)漆酶的影響Fig.11 The effect of natural C-source on laccase A:燕麥秸稈Oat straw;B:油菜秸稈Rape straw;C:玉米秸稈Maize straw;D:天然草地枯落物L(fēng)itter of natural grassland;E:芨芨草秸稈Achnatherum splendens straw.

2.6.8轉(zhuǎn)速對(duì)菌株310b產(chǎn)漆酶的影響 分別在0，60，90，120，150，180 r/min不同轉(zhuǎn)速條件下考察對(duì)菌株310b產(chǎn)漆酶活力，由圖10可以看出，從60～180 r/min隨著轉(zhuǎn)速的增加，漆酶活力增加，在轉(zhuǎn)速為180 r/min的條件下，菌株310b產(chǎn)漆酶活力達(dá)到最大(圖10)。

2.6.9天然碳源對(duì)菌株310b產(chǎn)漆酶的影響 天然草地枯落物最適于菌株310b產(chǎn)漆酶，其次為油菜秸稈、燕麥秸稈和芨芨草秸稈產(chǎn)酶量較低。玉米秸稈誘導(dǎo)菌株產(chǎn)漆酶活力最低(圖11)。

2.6.10底物添加量對(duì)菌株310b產(chǎn)漆酶的影響 不同秸稈添加量對(duì)菌株310b產(chǎn)漆酶活力不同，從0～1 g隨著秸稈添加量的增加，漆酶活力增加；1～2 g范圍內(nèi)，隨著秸稈添加量的增加，漆酶活力減小(圖12)。

3 討論

3.1 產(chǎn)漆酶真菌的篩選

愈創(chuàng)木酚既是漆酶的氧化底物又是漆酶生物合成的誘導(dǎo)劑，α-萘酚對(duì)于漆酶的產(chǎn)生具有一定促進(jìn)作用，以愈創(chuàng)木酚-PDA培養(yǎng)基和α-萘酚-PDA培養(yǎng)基結(jié)合使用可以保證所選出的產(chǎn)酶菌株是漆酶生產(chǎn)菌種, 而非愈創(chuàng)木酚氧化酶的生產(chǎn)菌株[18]。本研究根據(jù)漆酶本身的性質(zhì)、催化底物以及微生物生產(chǎn)漆酶的特性，設(shè)計(jì)初步篩選產(chǎn)漆酶菌株的選擇性培養(yǎng)基平板, 根據(jù)菌體生長(zhǎng)及菌落大小、漆酶催化氧化還原反應(yīng)產(chǎn)生的變色圈直徑平均值及其變色圈顏色深淺程度，進(jìn)行產(chǎn)漆酶菌株的篩選。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn), 不同菌株在愈創(chuàng)木酚-PDA培養(yǎng)基和α-萘酚-PDA培養(yǎng)基2種平板上的顯色反應(yīng)有差別，這可能是在培養(yǎng)過(guò)程中這2種底物對(duì)不同菌株漆酶生物合成的誘導(dǎo)作用不同，這種現(xiàn)象的產(chǎn)生除了與菌株所合成漆酶的產(chǎn)量、活力和類型有關(guān)外, 可能還與不同菌株所產(chǎn)的漆酶對(duì)于愈創(chuàng)木酚和α-萘酚的催化專一性差別有關(guān)。另外，不同菌株在兩種平板培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)速度不同，因此漆酶催化氧化還原反應(yīng)產(chǎn)生的變色圈直徑與菌落大小沒(méi)有必然的相關(guān)性。同一菌株在不同底物的平板培養(yǎng)基上的顯色圈相對(duì)大小不完全相同, 但大多數(shù)菌株呈現(xiàn)出了較好的一致性，在變色圈所顯色澤和強(qiáng)度方面, 所有顯色菌株在同種選擇培養(yǎng)基的不同平行平板中都能顯示出幾乎一致的色澤與直徑大小, 說(shuō)明選擇平板的穩(wěn)定性和高度可重復(fù)性。

圖12 秸稈添加量對(duì)310b產(chǎn)漆酶的影響Fig.12 The effect of straw amount on laccase

3.2 發(fā)酵條件對(duì)產(chǎn)酶活力的影響

環(huán)境因素諸如溫度、pH值、碳源、氮源等顯著影響真菌漆酶的產(chǎn)生，影響效果因菌株而異[25]。在本實(shí)驗(yàn)中，菌株310b在25℃時(shí)產(chǎn)漆酶活力最大，pH 4.0時(shí)漆酶活力最大，蔗糖和蛋白胨分別為最有利于漆酶合成的碳、氮源，鄰甲苯胺、α-萘酚和吐溫-80促進(jìn)菌株310b漆酶的合成；愈創(chuàng)木酚、鄰苯二酚、單寧酸、吲哚乙酸抑制菌株產(chǎn)酶，其中吲哚乙酸抑制作用最強(qiáng)烈α-萘酚和吐溫-80對(duì)菌株產(chǎn)酶沒(méi)有明顯影響；愈創(chuàng)木酚、單寧酸、吲哚乙酸抑制菌株產(chǎn)酶，其中吲哚乙酸抑制作用最強(qiáng)烈。隨Cu2+增加，產(chǎn)漆酶活力增加，0.025 g/L時(shí)產(chǎn)酶活力最大。隨著接種量的增加，誘導(dǎo)漆酶活力增加。從60～180 r/min隨著轉(zhuǎn)速的增加，漆酶活力增加。從0～1 g隨著秸稈添加量的增加，漆酶活力增加；1～2 g范圍內(nèi)，隨著秸稈添加量的增加，漆酶活力減小。不同來(lái)源漆酶的最適溫度、最適pH 值有差異, 無(wú)機(jī)離子對(duì)其影響也不完全相同, 這說(shuō)明不同來(lái)源漆酶的化學(xué)組成可能不同; 所以在分離和篩選高酶活菌株時(shí)應(yīng)考慮這些因素的影響。

3.3 產(chǎn)漆酶真菌的種類

據(jù)報(bào)道，產(chǎn)漆酶真菌不下于1000 種，而且超過(guò)100 種真菌漆酶，已經(jīng)從相應(yīng)的培養(yǎng)物中被純化，并對(duì)其理化特性做了深入研究[15]。有許多報(bào)道稱子囊菌綱(Ascomycetes)的許多真菌產(chǎn)漆酶，例如Gaeumannomycesgraminis、Magnaporthegrisea、Ophiostomanovoulmi、Melanocarpusalbomyces、Monocilliumindicum、Neurosporacrassa、Podosporaanserina等，但是沒(méi)有做系統(tǒng)研究，很難確定具體有多少種子囊菌產(chǎn)漆酶。此外，漆酶在擔(dān)子菌綱(Basidiomycetes)和半知菌綱(Deuteromycetes)中也分布廣泛，例如研究較多的白腐菌、革菌屬、栓菌屬、蜜環(huán)菌屬、多孔菌屬、鬼傘屬等，而漆酶產(chǎn)量普遍較高的主要是彩絨革蓋菌[26]。近年來(lái)關(guān)于真菌產(chǎn)漆酶的報(bào)道較多，如：血紅密孔菌(Pycnoporussanguineus)[27]、Paecilomycesmajor[28]、Penicilliumsimplicissimum[29]、煙管菌(Bjerkanderaadstar)[30]、Trichodermasp. LaTr01[31]、Sopharajaponica[32]、Geotrichumcandidum[33]、Trichodermaviride[34]、Trichodermasp. Z-3[35]、Trichodermasp.[36]、Curvularialunata[37]、PolyporusarculariusA08[23]、TrichodermaasperellumW03[38]等。研究?jī)?nèi)容集中在產(chǎn)酶菌株的篩選和發(fā)酵條件的優(yōu)化，從東祁連山高寒草地土壤中篩選到了1株產(chǎn)漆酶菌株，經(jīng)rDNA-ITS 序列分析結(jié)果，初步鑒定為：小皮傘屬(Marasmiustricolor)。小皮傘屬真菌(MarasmiusFr.)在分類學(xué)上隸屬于擔(dān)子菌門(Basidiomycota)、擔(dān)子菌綱(Basidiomycetes)、傘菌亞綱(Agaricomycetidae)、傘菌目(Agaricales)、小皮傘科(Marasmiaceae)[39]，其地生、木生或生于林中的枯枝落葉上，在我國(guó)29個(gè)省區(qū)有分布[40]。目前為止尚未見(jiàn)到小皮傘屬真菌產(chǎn)漆酶的相關(guān)報(bào)道。

盡管漆酶的應(yīng)用價(jià)值廣，但是植物、動(dòng)物、昆蟲等天然來(lái)源的漆酶產(chǎn)量低、價(jià)格昂貴，而真菌大多在惡劣環(huán)境下才會(huì)啟動(dòng)漆酶的表達(dá)系統(tǒng)。依賴野生天然來(lái)源的漆酶生產(chǎn)，難以滿足工業(yè)需求，漆酶的產(chǎn)業(yè)化受到限制。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，漆酶的異源表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建和利用為漆酶工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)提供了一條新的可發(fā)展途徑，但是，為實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)，必須明確產(chǎn)漆酶真菌的資源。因此，從不同環(huán)境中分離和篩選產(chǎn)漆酶真菌，挖掘產(chǎn)漆酶真菌資源，仍然是人們繼續(xù)努力的方向和目標(biāo)。