高效穩(wěn)定纖維素分解菌群篩選及其分解特性研究

王得武，姚拓，楊巧麗，韓華雯，張英，盧虎，滾雙寶*

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

纖維素是地球上分布最廣、含量最豐富的可再生資源，廣泛存在于園林、秸稈、畜禽糞便等有機(jī)固體廢棄物中[1-3]，但這些資源的利用率極低，目前僅有約11%被用于造紙、燃料、飼料、生產(chǎn)農(nóng)作物產(chǎn)品和建筑等方面，剩余的絕大多數(shù)在自然界中被微生物降解轉(zhuǎn)化，最終生成CO2和H2O，構(gòu)成了生態(tài)系統(tǒng)中碳循環(huán)的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，但從人類利用自然能源的角度來(lái)看，這卻是一個(gè)巨大的浪費(fèi)[4-5]，同時(shí)還派生了一系列的生態(tài)和環(huán)境問(wèn)題。利用微生物技術(shù)是實(shí)現(xiàn)這些纖維素資源能源化、肥料化及解決相關(guān)環(huán)境問(wèn)題的一種有效途徑。目前應(yīng)用和研究的纖維素分解菌多為單菌株，工業(yè)生產(chǎn)纖維素酶的微生物菌種大多都是絲狀真菌，然而單菌株往往存在纖維素酶系不夠完整[6]、酶活不穩(wěn)定、酶作用pH范圍狹窄及產(chǎn)酶成本高等問(wèn)題[7]，纖維素分解能力有限。自然界中，纖維素在多種微生物共同作用下被分解從而進(jìn)入碳素循環(huán)。因此，微生物群體功能的研究越來(lái)越受到關(guān)注[2,7-11]。如崔宗均等[8]利用限制性培養(yǎng)技術(shù)和優(yōu)化組合方法，篩選馴化了一組高效而穩(wěn)定的纖維素分解復(fù)合菌系MC1，該復(fù)合菌系的分解能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于純培養(yǎng)的單個(gè)菌株，并能夠有效的分解經(jīng)化學(xué)處理的木質(zhì)纖維素材料[8-9]，王偉東等[2]篩選的復(fù)合菌系WSC-6具有與MC1類似的高效分解特性[2,10]，但這兩組復(fù)合系屬于高溫菌群(50℃左右)，常溫條件下應(yīng)用受到一定的限制。

本研究以森林腐殖質(zhì)、腐爛的玉米秸稈、牛場(chǎng)料槽旁土樣、麥垛底部土樣和牛雞糞混合儲(chǔ)糞池中土樣為原材料，篩選出了一組常溫條件能高效降解纖維素的微生物群體，并對(duì)該菌群的木質(zhì)纖維素分解能力、不同酸堿條件下的纖維素分解能力及其菌株組成特性進(jìn)行了研究，以期為其進(jìn)一步研究與推廣應(yīng)用提供理論依據(jù)與技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌種來(lái)源 森林腐殖質(zhì)、腐爛的玉米秸稈、牛場(chǎng)料槽旁土樣、麥垛底部土樣和牛雞糞混合儲(chǔ)糞池中土樣。

1.1.2培養(yǎng)基[12]蛋白胨5 g，酵母膏5 g，纖維素(新華濾紙)5 g，NaCl 5 g，CaCO32 g，K2HPO41 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.5 mg，MnSO4·H2O 0.16 mg，ZnSO4·7H2O 0.16 mg，CoCl20.2 mg，加蒸餾水至1000 mL，pH 7.0，121℃滅菌25 min。

1.1.3纖維材料 濾紙(大小為2 cm×6 cm)以1%醋酸浸泡過(guò)夜后，用蒸餾水反復(fù)浸泡洗至中性，80℃烘干備用。秸稈和木屑粉碎過(guò)1 mm篩，蒸餾水煮沸10 min，以3層沙布過(guò)濾沖洗，80℃烘干恒重后備用。

1.2 方法

1.2.1纖維素分解菌群的篩選 于2011年10月-2012年1月，取篩選所用材料(見(jiàn)1.1.1)各5 g，分別接入100 mL培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)(試驗(yàn)設(shè)6個(gè)重復(fù))，命名為第1代，待培養(yǎng)液中濾紙分解至不再明顯變化，取菌液5 mL接入新鮮培養(yǎng)基(見(jiàn)1.1.2)，命名為第2代，重復(fù)接種，依次為3，4，……，n代,根據(jù)濾紙條的斷裂程度判斷降解效果：(+)濾紙邊緣膨脹；(++)為濾紙邊緣不定形；(+++)濾紙整體不定形；(++++)濾紙成團(tuán)糊狀；(+++++)濾紙完全成糊狀。培養(yǎng)條件：28～32℃，80 r/min微震。

1.2.2纖維素分解菌群對(duì)不同纖維材料分解能力的測(cè)定 分別以0.5 g的濾紙、玉米秸稈、稻草秸稈、小麥秸稈、柞木木屑和楊木木屑為培養(yǎng)基唯一碳源(不含原培養(yǎng)基中的碳源)制作100 mL培養(yǎng)基，接種5 mL纖維素分解菌群，培養(yǎng)條件同1.2.1，6 d后利用失重法測(cè)定不同纖維材料的分解量(失重量)，計(jì)算分解率(失重率)，具體方法如下：參考測(cè)定飼料粗纖維使用的尼龍袋技術(shù)[13]及測(cè)定土壤纖維分解強(qiáng)度使用的尼龍網(wǎng)袋法[14]，利用38 μm尼龍袋過(guò)濾培養(yǎng)基，再用大量蒸餾水沖洗，80℃烘干，恒重，計(jì)算。纖維材料分解率=(纖維材料原質(zhì)量+尼龍袋質(zhì)量-烘干后纖維材料與尼龍袋質(zhì)量和)/纖維材料原質(zhì)量×100%。

1.2.3不同初始pH值下纖維素分解菌群對(duì)濾紙分解效果的測(cè)定 以濾紙為培養(yǎng)基唯一碳源制作100 mL培養(yǎng)基，將培養(yǎng)基初始pH值調(diào)至5，6，7，8，9，10和11，分別接種5 mL纖維素分解菌群，培養(yǎng)條件同1.2.1，每隔12 h測(cè)定培養(yǎng)基pH值，并觀察培養(yǎng)基濾紙崩解的情況，待培養(yǎng)基pH值穩(wěn)定后測(cè)定濾紙分解量，計(jì)算分解率，測(cè)定方法同1.2.2。

1.2.4纖維素分解菌群?jiǎn)尉甑姆蛛x及菌株組合對(duì)濾紙分解能力的測(cè)定 培養(yǎng)基加入1.5%的瓊脂制作固體培養(yǎng)基，取纖維素分解菌群用生理鹽水稀釋至10-5，10-6，10-7分別涂平板。將涂好的平板放入32℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3 d，培養(yǎng)好氧菌；將涂好的平板裝入?yún)捬醮婵粘闅? min，再充氮?dú)? min，反復(fù)操作3次，將厭氧袋封口，置于32℃培養(yǎng)箱內(nèi)5 d，培養(yǎng)兼性厭氧菌。根據(jù)平板培養(yǎng)基上菌落形態(tài)差異，多次劃線分離直至純化為單菌，對(duì)分離的單菌株相互組合接入以濾紙為唯一碳源的培養(yǎng)基，培養(yǎng)6 d測(cè)定濾紙的分解率，測(cè)定方法同1.2.2。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2003軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和繪圖，采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 纖維素分解菌群的篩選

由表1可以看出，以森林腐殖質(zhì)、腐爛的玉米秸稈、牛場(chǎng)料槽旁土樣、麥垛底部土樣作為原材料，傳代過(guò)程中培養(yǎng)基中濾紙有變軟、邊緣崩解跡象，但始終不能徹底分解濾紙，至第10代，淘汰以上述材料篩選的菌群。

從牛、雞糞混合儲(chǔ)糞池中的土樣篩選的菌群，第1代培養(yǎng)基中濾紙240 h完全崩解，第2代培養(yǎng)基中濾紙120 h完全崩解，第3代培養(yǎng)基中濾紙72 h完全崩解，從第6代以后，濾紙崩解時(shí)間逐步穩(wěn)定到48 h左右，經(jīng)過(guò)30代培養(yǎng)，獲得了一組高效、穩(wěn)定的纖維素分解菌群(圖1)。

2.2 纖維素分解菌群對(duì)不同纖維材料分解力

分解率與絕對(duì)分解量是反映菌群分解潛力的重要指標(biāo)。纖維材料不同，分解強(qiáng)度差異較大。纖維素分解菌群6 d分解濾紙0.47 g，分解率達(dá)94.95%，顯著高于其他纖維材料的分解量及分解率；對(duì)秸稈的分解能力居中，6 d分解率為45%左右；對(duì)柞木木屑和楊木木屑分解率則較低，6 d分解率分別為11.00%和1.22%(表2)。表明纖維素分解菌群對(duì)純纖維素材料的分解能力極強(qiáng)，對(duì)秸稈類木質(zhì)纖維素材料具有較高的分解能力，但對(duì)木材類木質(zhì)纖維原料分解能力較差。

表1 不同材料所篩菌群對(duì)濾紙的分解效果Table 1 Filter paper decomposition of isolated microbial community from different materials

2.3 不同初始pH值下纖維素分解菌群對(duì)濾紙的分解效果

圖1 不同代纖維素分解菌群對(duì)濾紙的分解效果Fig.1 Effects of different culture times on filter paper decomposition in cellulose microbial community 圖中標(biāo)注時(shí)間為濾紙崩解成糊狀所需時(shí)間。The marked time in figure were the degradation time of filter paper into paste completely.

分別對(duì)初始pH為5～11的培養(yǎng)基接種后，24 h培養(yǎng)液的pH為8左右，之后的84 h內(nèi)pH值在7.5～9.2范圍內(nèi)輕微波動(dòng)，108 h后最終穩(wěn)定在8.5～8.8之間(圖2)，表明纖維素分解菌群在初始pH為5～11的條件下適應(yīng)能力極強(qiáng)，能夠快速調(diào)節(jié)并穩(wěn)定反應(yīng)體系pH值。

由表3可以看出，濾紙分解率與濾紙崩解時(shí)間變化較為一致，濾紙崩解所需時(shí)間越短，濾紙分解率越高。初始pH 7～10條件下，濾紙48 h被分解為糊狀，6 d分解0.47～0.48 g，分解率達(dá)94.37%～95.26%，表明纖維素分解菌群能夠適應(yīng)該酸堿條件并在該條件下具有極強(qiáng)的纖維素分解能力。初始pH為5，10和11的條件下，菌群能夠?qū)⒎磻?yīng)體系pH迅速調(diào)節(jié)至正常范圍內(nèi)，雖然濾紙崩解時(shí)間明顯延長(zhǎng)，濾紙分解率降低，但仍高達(dá)84.59%，表明該酸堿條件對(duì)菌群分解能力有一定的影響，但仍具有較強(qiáng)的纖維素分解能力。

結(jié)合圖2、表3發(fā)現(xiàn)，濾紙崩解前培養(yǎng)液pH值波動(dòng)較大，濾紙完全崩解后，培養(yǎng)基pH值平緩變化，反應(yīng)體系pH值的變化在一定程度上反映了纖維素分解菌群對(duì)纖維素的降解程度。

2.4 纖維素分解菌群?jiǎn)尉攴蛛x及菌株組合對(duì)濾紙的分解能力

纖維素分解菌群經(jīng)過(guò)平板分離培養(yǎng)，得到一系列形態(tài)特征明顯的菌落，對(duì)各個(gè)菌落在同樣的培養(yǎng)條件下劃線分離純化，得到8株真菌、6株細(xì)菌和3株放線菌，對(duì)這17株單菌以不同的方式相互組合(表4)接種培養(yǎng)6 d，發(fā)現(xiàn)濾紙分解率均低于1.25%，而纖維素分解菌群6 d對(duì)濾紙的分解率高達(dá)94.95%(表2)，表明分離得到的菌株幾乎不具備纖維素分解能力，說(shuō)明纖維素分解菌群中含有傳統(tǒng)的平板培養(yǎng)分離方法不能獲得的菌株，且未分離到的菌株在纖維素降解過(guò)程中起關(guān)鍵性作用，同時(shí)表明纖維素分解菌群具有菌種組成多樣性和作用機(jī)理復(fù)雜性的特點(diǎn)。

表2 纖維素菌群對(duì)濾紙、秸稈、木屑的分解能力Table 2 Degradation activity of filter paper, straw, and sawdust by cellulose composite microbial strains

注：表中不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。

Note：Different lowercase in the table mean significant difference at 0.05 level. The same below.

圖2 不同初始pH值條件下pH值變化曲線Fig.2 pH changes with incubation time in different initial pH values

3 討論

3.1 纖維素分解菌群的篩選

森林腐殖質(zhì)、堆放腐爛的玉米秸稈等材料中含有大量的纖維素分解菌，但可能由于其菌源采集環(huán)境與篩選所用培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)條件差異太大，部分纖維素分解菌難以通過(guò)人工篩選獲得。長(zhǎng)期堆放牛糞和雞糞的儲(chǔ)糞池中纖維素原料、粗蛋白及微生物和酶所需的磷、鉀、鋅、銅等元素含量豐富[15]，纖維素分解菌富集，且該條件下?tīng)I(yíng)養(yǎng)狀況與本研究篩選所用培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)條件較為相近，更有利于纖維素分解菌的篩選。微生物降解纖維素是酶催化的過(guò)程，纖維素完全降解成葡萄糖至少需要多種功能不同的但又互補(bǔ)的纖維素酶組分協(xié)同作用才能完成[16]。同一種菌株產(chǎn)生所需全部酶類且活性都很高的幾率并不大，而且效率較低。本研究通過(guò)連續(xù)傳代培養(yǎng)，篩選優(yōu)勢(shì)菌群，強(qiáng)化菌株之間的協(xié)同作用，同時(shí)也是對(duì)菌群酶系優(yōu)化的過(guò)程，有針對(duì)性地篩選出能產(chǎn)生高效復(fù)合酶的專用型復(fù)合菌群，這與研究者們提出的通過(guò)對(duì)纖維素酶酶系組分的重建構(gòu)從而優(yōu)化降解酶系， 提高對(duì)纖維素底物的降解效率的策略相一致[17]。纖維素分解菌群能夠在48 h左右將濾紙分解成糊狀，也證明了其分解纖維素的高效性。此外，經(jīng)過(guò)30代培養(yǎng)篩選的菌群本身就是一個(gè)微生態(tài)系統(tǒng)，菌株個(gè)體之間協(xié)同作用強(qiáng)，形成一個(gè)有機(jī)整體，功能穩(wěn)定、抵抗外界環(huán)境能力強(qiáng)，具有較高的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

表3 不同初始pH值條件下對(duì)濾紙分解Table 3 Decrease of filter paper in different initial pH value

表4 菌株不同組配方式下對(duì)濾紙的分解能力Table 4 The decomposition ability of bacterial strains to filter paper in the different combinations

3.2 纖維素分解菌群對(duì)不同纖維材料分解力

纖維材料的木質(zhì)素的含量、比表面積、結(jié)晶度及聚合度等因素是影響微生物降解纖維素材料的主要影響因素。濾紙是聚合度和結(jié)晶度都居中等的純纖維材料，纖維素分解菌群對(duì)其分解強(qiáng)度極高，6 d分解率達(dá)94.95%。秸稈和木材等木質(zhì)纖維素材料細(xì)胞壁化學(xué)成分主要包括纖維素、半纖維素和木質(zhì)素，其結(jié)構(gòu)復(fù)雜，性質(zhì)穩(wěn)定[18]，自然條件下降解極為困難。有報(bào)道表明，纖維素酶、半纖維素酶及附屬酶(包括脫支酶、酚酸酯酶)，以及木質(zhì)素降解與修飾酶等酶是降解天然細(xì)胞材料的必需組分[4]，對(duì)未經(jīng)處理的小麥秸稈粉、稻草秸稈粉及玉米秸稈粉在纖維素酶過(guò)量(100 UFPA)條件下酶解48 h，酶解率均低于10%[19]，可見(jiàn)僅依靠纖維素酶無(wú)法完成對(duì)天然植物原料細(xì)胞壁中纖維素的降解。本研究篩選的纖維素分解菌群常溫條件下對(duì)不做化學(xué)處理的玉米秸稈、稻草秸稈、小麥秸稈6 d分解率分別達(dá)48.52%，45.05%和44.30%，表明纖維素分解菌群產(chǎn)生了降解木質(zhì)纖維的部分酶系，能夠高效的降解玉米秸稈等木質(zhì)纖維素材料，因此，該菌群在秸稈等農(nóng)業(yè)廢棄資源利用等領(lǐng)域具有一定的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值，對(duì)促進(jìn)農(nóng)業(yè)循環(huán)經(jīng)濟(jì)有積極的意義[20]。纖維素分解菌群對(duì)木材纖維原料分解率較低，木材原料不同，其分解率差異較大，對(duì)堅(jiān)硬沉重的柞木分解率為11.00%，而對(duì)較為輕柔的楊木分解率僅為1.22%，這可能與木材結(jié)構(gòu)的復(fù)雜程度及木質(zhì)素含量有關(guān)。

3.3 不同初始pH值下纖維素分解菌群對(duì)濾紙的分解效果

pH值是反映一個(gè)反應(yīng)體系穩(wěn)定性的重要指標(biāo)，在纖維素分解菌的發(fā)酵液中pH值的不穩(wěn)定是抑制纖維素分解活性的主要原因之一[10]。本研究對(duì)初始pH值為5～11的培養(yǎng)基中接入纖維素分解菌群培養(yǎng)6 d，反應(yīng)體系pH值最終調(diào)節(jié)并穩(wěn)定在8.0～8.8之間，表明纖維素分解菌群pH值適應(yīng)及調(diào)節(jié)能力極強(qiáng)，這與崔宗均等[8]篩選的復(fù)合系MC1和復(fù)合系WSC-6有類似的pH值調(diào)節(jié)特性[10]，不同之處是復(fù)合系MC1和復(fù)合系WSC-6的pH變化曲線較為平緩，本研究篩選的菌群pH調(diào)節(jié)過(guò)程則呈波動(dòng)的方式，且pH值曲線的波動(dòng)與濾紙的分解效果存在一定的相關(guān)性，其原理目前尚不清楚，還需要進(jìn)一步研究。此外本研究篩選的纖維素分解菌群中性條件下對(duì)濾紙的分解率為95%左右，稍低于復(fù)合系WSC-6在中性條件下對(duì)濾紙的分解率[10]，但在堿性條件對(duì)纖維素的分解具有明顯優(yōu)勢(shì)。

3.4 纖維素分解菌群?jiǎn)尉攴蛛x及菌株組合對(duì)纖維素的分解能力

自然界中，多種菌株構(gòu)成的微生物菌群能夠分解很多難分解的物質(zhì)，這些微生物只有在一起才具備分解某種物質(zhì)的功能，生存環(huán)境發(fā)生改變或缺少其中某一種或某幾種微生物后，整個(gè)微生物群的分解能力會(huì)下降，甚至功能喪失。另外，這些微生物群落中各個(gè)菌種之間存在協(xié)同作用并相互依存，各菌種對(duì)環(huán)境要求苛刻，大部分都無(wú)法通過(guò)實(shí)驗(yàn)室分離培養(yǎng)，常規(guī)的平板分離技術(shù)只能得到很小的一部分信息。本研究篩選的纖維素分解菌群能夠高效分解纖維素，利用平板技術(shù)對(duì)該菌群分離得到的17株單菌相互組合，發(fā)現(xiàn)人工組合的菌群不具備纖維素分解能力，說(shuō)明纖維素分解菌群中含有傳統(tǒng)平板培養(yǎng)分離方法不能獲得的菌株，且未分離到的菌株在纖維素降解過(guò)程中起關(guān)鍵性作用，推斷分離得到的菌株可能是纖維素分解菌，但所產(chǎn)酶系不健全，不具備纖維素分解能力；或是纖維素分解菌的伴生菌[21]，雖然不能分解纖維素，但能夠利用纖維素分解產(chǎn)生的糖類物質(zhì)，減小糖類物質(zhì)對(duì)后續(xù)反應(yīng)的抑制，對(duì)纖維素的分解起促進(jìn)作用[22]。因此，纖維素分解菌群的菌種組成及其菌間關(guān)系還待于進(jìn)一步的研究。

4 結(jié)論

1)本研究篩選出了纖維素分解能力強(qiáng)且功能穩(wěn)定的纖維素分解菌群。2)篩選出的纖維素分解菌群能夠高效分解秸稈類木質(zhì)纖維材料，為秸稈等天然木質(zhì)纖維原料的資源化利用提供了一定的理論依據(jù)。另外，該菌群還具有較強(qiáng)的酸堿適應(yīng)及調(diào)節(jié)能力。3)對(duì)纖維素分解菌群進(jìn)行分離、純化得到的真菌、細(xì)菌和放線菌以不同方式相互組配，構(gòu)建的人工菌群不具備纖維素分解能力。