纖維素酶酶解-溶劑聯(lián)合提取蔥白中甾體化合物*

程璐，張耕

(武漢市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院藥學(xué)部，武漢 430022)

蔥白為百合科植物分蔥(Allium fisturosum L.vat.caespitosum Makio)或香蔥(Allium schoenoprasum L.)的新鮮鱗莖。其性辛、溫，具解表、通陽散寒之功效。研究表明，以蔥白為原料的藥物制劑可用來防治冠心病心絞痛、抗動(dòng)脈粥樣硬化、治療急慢性心肌缺血、保護(hù)缺糖缺氧心肌細(xì)胞、抑制血管平滑肌細(xì)胞增生、保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞、減輕球囊損傷后再狹窄等[1-6]。筆者在本實(shí)驗(yàn)中研究采用纖維素酶酶解法提取蔥白中的甾體化合物，為蔥白有效成分提取和研究提供新的思路。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 UV-1601紫外-可見分光光度計(jì)(日本島津);HHS系列電熱恒溫水浴鍋(武漢市琴臺(tái)醫(yī)療器械廠);BP310S電子天平(德國賽多利斯，d=0.001 g);ME215S電子天平(德國賽多利斯，d=0.1 mg)。九陽榨汁機(jī)(用于勻漿)。

1.2 試藥 纖維素酶(BIOSHARP公司，批號(hào):058K3787，規(guī)格:11000 U·mg－1);β-谷甾醇對照品(Sigma公司，批號(hào):058K3787，含量 100.0%);甲醇、乙醇、硫酸、冰醋酸、三氯甲烷均為分析純。蔥(自種，經(jīng)華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院張長弓副教授鑒定為分蔥，剪取新鮮蔥白洗凈)。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品制備方法 取蔥白20 g，加純化水100mL，加纖維素酶適量，室溫下勻漿5 min，放置一定時(shí)間后用三氯甲烷萃取3次，每次100mL，合并三氯甲烷液濃縮并定容至100mL量瓶中，精密量取10mL蒸干，精密加入硫酸-甲醇(9∶1)顯色劑溶液2mL，搖勻，100℃水浴反應(yīng)30 min，取出后立即用冰水浴冷卻10 min終止反應(yīng)，精密加入冰醋酸10mL，搖勻，即得。

2.2 對照品溶液制備方法 精密稱取β-谷甾醇對照品11.35 mg，置100mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度。

2.3 檢測波長的選擇 取對照品溶液與供試品溶液各適量于具塞試管中，水浴揮干溶劑后按“2.1”項(xiàng)下方法顯色后在300～700nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。結(jié)果對照品和供試品的最大吸收波長分別為386和381nm，選擇386nm為檢測波長。

2.4 線性關(guān)系考察 分別吸取上述溶液0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0mL 置具塞試管中，水浴蒸干后加入硫酸-甲醇(9∶1)顯色劑2mL，搖勻，100℃水浴反應(yīng)30 min，取出后立即用冰水浴冷卻10 min終止反應(yīng)，精密加入冰醋酸10mL，搖勻，放置15 min后在386nm波長處測定吸光度，以吸光度(Y)為縱坐標(biāo)，濃度(X)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得回歸方程為:Y=0.0244X －0.0112，r=0.9998;結(jié)果表明 β-谷甾醇進(jìn)樣濃度與吸光度在 4.73 ～28.38μg·mL－1線性關(guān)系良好。

2.5 單因素考察

2.5.1 pH對酶解的影響 分別稱取蔥白20 g，分別置 pH 為 3.0，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，7.0的緩沖溶液100mL中，加入 0.4 mg·mL－1的纖維素酶，室溫下勻漿5 min，放置 1h后用三氯甲烷萃取 3次，每次100mL，合并三氯甲烷液濃縮并定容至100mL量瓶中，精密量取10mL蒸干，顯色后測定吸光度，計(jì)算總甾體化合物的含量，結(jié)果見圖1。由圖1可以看出，在pH＜5時(shí)隨著pH的增大，總甾體化合物的提取率顯著提高，當(dāng)pH為5.0時(shí)最高，之后隨著溶液堿性增強(qiáng)而下降。溶液pH影響著纖維素酶活性，進(jìn)而影響纖維素酶破壁效果及產(chǎn)物得率，pH最佳范圍為4.0～5.0。

圖1 pH對酶解的影響Fig.1 Effect of pH value on enzymatic hydrolysis

2.5.2 酶濃度對酶解的影響 分別稱取蔥白20 g，加純化水 100mL，分別加入濃度為 0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 mg·mL－1的纖維素酶，室溫下勻漿 5 min，放置1h后用三氯甲烷萃取3次，每次100mL，合并三氯甲烷液濃縮并定容至100mL量瓶中，精密量取10mL蒸干，顯色后測定吸光度，計(jì)算總甾體化合物的含量，結(jié)果見圖2。由圖2可以看出，隨著酶濃度的增大，總甾體化合物的提取率逐步提高，當(dāng)酶濃度為0.4 mg·mL－1時(shí)，總甾體化合物的提取率基本達(dá)到最大值，繼續(xù)增大酶濃度，得率無明顯上升趨勢，適宜濃度為 0.3 ～0.5 mg·mL－1。

2.5.3 溫度對酶解的影響 分別稱取蔥白20 g，加入0.4 mg·mL－1纖維素酶，分別加入溫度為 30，40，45，50，55，60，70 ℃的純化水 100mL，勻漿 5 min，并放置在相應(yīng)的溫度下，1h后用三氯甲烷萃取3次，每次100mL，合并三氯甲烷液濃縮并定容至100mL量瓶中，精密量取10mL蒸干，顯色后測定吸光度，計(jì)算總甾體化合物的含量，結(jié)果見圖3。由圖3可以看出，在低溫時(shí)，隨著溫度的升高總甾體化合物的提取率增大，在約50℃時(shí)達(dá)到最大值。纖維素酶通常在40～60℃下活性最高，溫度過低會(huì)抑制酶的活性，過高卻使酶蛋白變性失活，喪失催化能力。為使酶能保持較好的穩(wěn)定性并發(fā)揮其活性，酶解適宜溫度范圍為45～55℃。

圖2 酶濃度對酶解的影響Fig.2 Effect of enzyme concentration on enzymatic hydrolysis

圖3 溫度對酶解的影響Fig.3 Effect of temperature on enzymatic hydrolysis

2.5.4 時(shí)間對酶解的影響 分別稱取蔥白20 g，加純化水 100mL，并加入 0.4 mg·mL－1的纖維素酶，室溫下勻漿 5 min 后，分別放置 0.5，l.0，1.5，2.0，2.5，3.0 h后用三氯甲烷萃取3次，每次100mL，合并三氯甲烷液濃縮并定容至100mL量瓶中，精密量取10mL蒸干，顯色后測定吸光度，計(jì)算總甾體化合物的含量，結(jié)果見圖4。由圖4可以看出，隨著酶解時(shí)間的延長總甾體化合物的提取率增大，在1.5 h時(shí)基本達(dá)到最大值。延長酶解時(shí)間可提高總甾體化合物的提取率，但2 h之后總提取率略有提高，說明酶解已基本完成，再延長時(shí)間勢必增加能耗。

2.5.5 溶液體積對酶解的影響 分別稱取蔥白20 g，分別加純化水 50，100，150，200，250，300mL，并加入0.4 mg·mL－1纖維素酶，室溫下勻漿 5 min后，放置1h后用三氯甲烷萃取3次，每次100mL，合并三氯甲烷液濃縮并定容至100mL量瓶中，精密量取10mL蒸干，顯色后測定吸光度，計(jì)算總甾體化合物的含量，結(jié)果見圖5。由圖5可以看出，在采用溶液體積為100mL時(shí)總甾體化合物的提取率達(dá)到最大值，繼續(xù)增加溶液量提取率沒有明顯升高，且使用溶劑量較大也需要較大量的酶取樣量，增加萃取使用三氯甲烷的量，因此為減少能耗及提取損失最終采用100mL的水作為20 g蔥白的勻漿液。

圖4 時(shí)間對酶解的影響Fig.4 Effect of time on enzymatic hydrolysis

圖5 溶液體積對酶解的影響Fig.5 Effect of solution volume on enzymatic hydrolysis

2.5.6 正交實(shí)驗(yàn) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)，選擇酶解 pH(A)、酶濃度(B)、酶解溫度(C)、時(shí)間(D)為4個(gè)影響因素，每個(gè)因素分3個(gè)水平(表1)。根據(jù)L9(34)正交表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，測定并計(jì)算總甾體化合物的含量。表2結(jié)果顯示，影響蔥白含總甾體化合物提取的各因素主次順序是:酶解pH ＞酶解時(shí)間＞酶濃度＞酶解溫度，最佳條件組合為:A3B3C2D3，即最佳提取工藝條件為:酶解 pH 為 5.0，酶濃度為 0.5 mg·mL－1，酶解溫度為50℃，酶解時(shí)間為2 h。由表3可知，A、B、C、D 4個(gè)因素中酶解溫度對蔥白含總甾體化合物的提取效果沒有顯著性影響。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Tab.1 Factors and levels of orthogonal test

3 討論

酶是由生物體活細(xì)胞產(chǎn)生的一類特殊的生物催化劑，能夠參與和促進(jìn)活體細(xì)胞內(nèi)的各種化學(xué)、生化反應(yīng)。酶具有催化效率高、作用專一性強(qiáng)和催化條件溫和等特點(diǎn)，酶技術(shù)應(yīng)用于中藥領(lǐng)域，可以提高中藥有效成分的提取和分離效率，并且在中藥有效成分轉(zhuǎn)化上降低成本，提高轉(zhuǎn)化水平及產(chǎn)量。根據(jù)藥材植物細(xì)胞壁的構(gòu)成，選擇相對應(yīng)的酶，將細(xì)胞壁的組成成分水解或降解，使有效成分充分暴露出來，溶解、混懸或膠溶于溶劑中，從而達(dá)到提取細(xì)胞內(nèi)有效成分的目的[7]，常見可用于植物細(xì)胞破壁的酶有纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶等。

表2 正交實(shí)驗(yàn)安排與結(jié)果Tab.2 Design and results of orthogonal test

表3 正交實(shí)驗(yàn)方差分析結(jié)果Tab.3 Results of variance analysis of orthogonal test

纖維素酶是降解纖維素生成葡萄糖的一組酶的總稱，主要包含:內(nèi)切葡聚糖酶，纖維二糖水解酶、β-葡萄糖苷糖。纖維素酶具有分解纖維素，破壞細(xì)胞壁、增加植物細(xì)胞內(nèi)容物的溶出量及軟化纖維素的作用。其酶解機(jī)制:首先由內(nèi)切葡聚糖酶作用于纖維素的非結(jié)晶區(qū)，使其露出許多末端依次分解，纖維二糖水解酶從非還原區(qū)末端依次分解，產(chǎn)生纖維二糖，然后部分降解的纖維素進(jìn)一步由內(nèi)切酶和纖維二糖水解酶協(xié)同作用分解生成纖維二糖、三糖等低聚糖。最后再由β-葡萄糖營糖作用分解成葡萄糖[8]。

甾體化合物是蔥白的主要成分之一[9]，采用硫酸-甲醇顯色法[10-11]測定蔥白中的甾體化合物具有靈敏度高、重復(fù)性好，且比色法相對高效液相色譜法具有操作簡便、快速的優(yōu)點(diǎn)，其準(zhǔn)確度和測定結(jié)果的穩(wěn)定性均能滿足實(shí)驗(yàn)要求。

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