近紅外光譜法快速測定枇杷葉浸出物的含量*

李蕾蕾，林萍，王海霞，姬生國

(廣東藥學(xué)院中藥學(xué)院，廣州 510006)

枇杷葉來源于薔薇科枇杷屬植物枇杷Eriobotrya japonica(Thunb.)Lindl.的干燥葉，是常用中藥。研究表明其化學(xué)成分主要含有三萜酸類、揮發(fā)油類、黃酮類、多酚、倍半萜及糖苷類等[1]?！吨腥A人民共和國藥典》2010年版一部規(guī)定按醇溶性浸出物測定法(附錄XA)項下的熱浸法測定，用75%乙醇作溶劑，不得少于18%。但傳統(tǒng)的浸出物測定方法操作復(fù)雜、費時費力，不能實現(xiàn)快速分析[2]。近紅外光譜分析技術(shù)(near-infrared spectrum，NIRS)是一種方便、快速、無損的綠色分析技術(shù)，光譜特性穩(wěn)定，信息量大[3]，已被廣泛應(yīng)用于谷物、石油化工產(chǎn)品、食品、紡織品、煙草等的分析測定[4-9]。近年來，NIR技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用到中藥質(zhì)量控制及道地性研究等方面，本課題組已經(jīng)利用該技術(shù)對廣陳皮、廣藿香進(jìn)行了定性及定量模型的建立[10－15]。筆者在本研究利用該技術(shù)建立枇杷葉浸出物含量的近紅外定量模型，以期實現(xiàn)快速、準(zhǔn)確測定枇杷葉藥材浸出物含量。

1 材料

1.1 藥材 2012年2月和11月期間分別采集于廣東、湖北、河南、四川、浙江等省，經(jīng)廣東藥學(xué)院中藥學(xué)院姬生國教授鑒定為薔薇科植物枇杷Eriobotrya japonica(Thunb.)Lindl.的干燥葉。枇杷葉藥材經(jīng)低溫烘干后，粉碎過內(nèi)徑(850±29)μm(24目)篩為試驗用樣品，保存于自封袋中，置于干燥器中備用。

1.2 儀器 傅立葉變換近紅外光譜儀，配有漫反射積分球、樣品旋轉(zhuǎn)器和石英樣品杯、OMNIC光譜采集軟件和TQ8.0分析軟件(Nicolet 6700型，美國Thermo公司)。HH數(shù)顯恒溫水浴鍋(江蘇金壇市宏華儀器廠)，萬分之一天平(AY120，日本島津公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 枇杷葉浸出物含量的測定方法 取樣品粉末3 g，精密稱定，置100～250mL錐形瓶中，精密加入75%乙醇50～100mL，密塞，稱定質(zhì)量，靜置1h后，連接回流冷凝管，加熱至沸騰，并保持微沸1h。放冷后，取下錐形瓶，密塞，再稱定質(zhì)量，用75%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，用干燥濾器濾過，精密量取濾液25mL，至已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，在水浴上蒸干后，于105℃干燥3 h，置干燥器中冷卻30 min，迅速精密稱定質(zhì)量，以干燥品計算供試品中醇溶性浸出物的含量(%)。146批枇杷葉樣品的醇溶性浸出物的含量在15.39% ～26.60%之間，且分布均勻。

2.2 近紅外光譜的采集 取樣品粉末4 g，混合均勻后放入石英樣品杯，輕輕振搖使分布均勻。采用積分球漫反射測樣，分辨率8 cm－1;掃描64次;掃描范圍4000 ～12000 cm－1;溫度(22.0 ±0.5)℃;相對濕度35%～40%。每批樣品重復(fù)裝樣并掃描5次，求平均光譜。146批樣品的近紅外光譜疊加圖見圖1。

2.3 驗證集與校正集的選取 將146批枇杷葉樣品按照浸出物含量高低順序進(jìn)行排列，以4∶1的比例隨機(jī)分為校正集和驗證集，要保證驗證集浸出物含量范圍在校正集含量范圍之內(nèi)，使所選驗證樣品集更具代表性[16]。見表1。

2.4 光譜預(yù)處理 不同樣品受顏色、顆粒大小的不均勻及雜散光等影響，將導(dǎo)致近紅外光譜的基線漂移和光譜的不重復(fù)，因此，必須對原始光譜進(jìn)行預(yù)處理。利用TQ8.0軟件對樣品光譜進(jìn)行分析處理，采用偏最小二乘法(PLS)對校正集樣品建立校正模型，同時作交叉驗證，并用驗證集樣品對模型進(jìn)行外部驗證。以內(nèi)部交叉驗證決定系數(shù)(R2)、校正均方差(root-meansquare error of calibration，RMSEC)、預(yù)測均方差(rootmean-spuare error of prediction，RMSEP)為綜合指標(biāo)，考察不同預(yù)處理方法對模型建立的影響。其中，R2越接近1，說明樣品分析值與近紅外預(yù)測值相關(guān)性越好;RMSEC、RMSEP越小，說明模型的預(yù)測性能越好。最終確定最佳預(yù)處理方法為多元散射校正法(MSC)加二階導(dǎo)數(shù)法(Second derivative)，見表2。其中，表2中二階導(dǎo)數(shù)法所得結(jié)果R2最好，但RMSEC和RMSEP值相差較大，且主成分?jǐn)?shù)出現(xiàn)過擬合，故不采用。

2.5 建模波段的選擇 以 R2、RMSEC、RMSEP等為綜合指標(biāo)，考察不同建模波段對模型的影響，通過與其他波段的對比，明顯看出在4057～10221 cm－1吸光度變化明顯，信息豐富，確定此波段為最佳建模區(qū)間，見圖2，表3。

2.6 主因子數(shù)的選定 在回歸擬合模型建立時，主因子數(shù)對模型的穩(wěn)定性有很大影響，主因子數(shù)過多會導(dǎo)致過擬合，過少則預(yù)測精度不夠。本實驗以校正集內(nèi)部交叉驗證均方差(root-mean-square root of crossvalidation，RMSECV)為優(yōu)化參數(shù)，RMSECV越小，模型的預(yù)測精度越高，當(dāng)RMSECV值最小時，所選主因子數(shù)最佳。本實驗RMSECV最小值為1.83652，對應(yīng)的最佳主因子數(shù)為8。見圖3。

表1 校正集和驗證集樣品浸出物的含量分布Tab.1 Content distribution of the ethanol extracts from samples of calibration set and validation set %

表2 不同預(yù)處理方法對模型性能的影響Tab.2 Effect of different pretreatment methods on model performance

圖2 樣品的二階導(dǎo)數(shù)光譜圖Fig.2 The second derivative spectrogram of samples

2.7 校正模型的建立 運用TQ8.0定量分析軟件中PLS法建立校正模型，圖4為118份樣品交互驗證得到的NIR預(yù)測值與參考值之間的相關(guān)圖，可以看出，校正集樣品均勻地分布在回歸線的兩側(cè)。經(jīng)內(nèi)部交叉驗證得 RMSEC=0.387，R2=0.98428。圖 5 為校正集樣本與預(yù)測集樣本的NIR預(yù)測值與參考值之間的絕對偏差圖，可以看出，NIR測定值與藥典法測定值之間的絕對偏差在±1.3之間。

表3 不同建模區(qū)間對模型性能的影響Tab.3 Effect of different spectrum range on model performance %

圖3 RMSECV值隨主成分的變化圖Fig.3 Chart of RMSECV changes with main ingredients

圖4 校正集樣品交互驗證得到的NIR預(yù)測值與參考值之間的相關(guān)圖○校正集;+驗證集Fig.4 Correlogram between NIR predicted values and reference value by cross validation of the calibration set samples○calibration;+validation

2.8 校正模型和驗證 近紅外光譜經(jīng)過 MSC和Second Derivative處理后，在 4057 ～10221cm－1，選擇前8個主成分建立了最優(yōu)校正模型。該模型的R2=0.98428，RMSEC=0.387，RMSEP=0.659。以預(yù)測值與分析值的比值為預(yù)測回收率，28批驗證集樣品的平均預(yù)測回收率為99.55%。對于給定顯著性水平0.05，t(0.05，28)=1.70，經(jīng)配對 t檢驗，28個樣品 NIR 預(yù)測值與熱浸法測定值的t檢驗值為0.927，即兩種方法的分析結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義，該模型通過驗證，可以準(zhǔn)確預(yù)測其覆蓋范圍的枇杷葉中浸出物含量。見表4。計算得平均回收率99.55%。

圖5 校正集樣本與預(yù)測集樣本的NIR預(yù)測值與參考值之間的絕對偏差圖○校正集;+驗證集Fig.5 Chart of the absolute deviation between NIR predicted values and references value of the calibration set samples and prediction set samples○calibration;+validation

3 討論

在近紅外光譜波長選擇時，其中在4057～10221 cm－1波段中，5155 和6880 cm－1是水分子組合頻吸收的兩個譜帶，主要包含藥材中水分等有關(guān)信息，同時枇杷葉的主要化學(xué)成分三萜類、單環(huán)倍半萜類、黃酮類、多酚類、糖苷類等成分中含－OH基豐富，－OH基的倍頻與合頻的吸收帶分別在6897和4831 cm－1[3]，故最終采用 4057 ～10221cm－1波段。

筆者利用近紅外光譜技術(shù)結(jié)合化學(xué)計量法獲得枇杷葉藥材樣品中的有效信息，通過與對應(yīng)樣品中浸出物的含量進(jìn)行線性擬合而建立浸出物含量測定模型。傳統(tǒng)的浸出物含量測定方法操作繁瑣，耗時較長，需要大量試劑，且實驗過程操作誤差較大;本研究建立的測定方法，操作簡便、測定速度快、對藥材成分沒有損害，可準(zhǔn)確預(yù)測未知樣品的浸出物含量。

表4 驗證集樣品的預(yù)測Tab.4 The prediction of validation set samples %

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