槐定堿通過Caspase-3介導(dǎo)的人胰腺癌細(xì)胞株capan-1凋亡機(jī)制研究

任麗平，李先佳，金少舉

·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)·

槐定堿通過Caspase-3介導(dǎo)的人胰腺癌細(xì)胞株capan-1凋亡機(jī)制研究

任麗平1，李先佳2，金少舉1

目的 探討槐定堿對人胰腺癌細(xì)胞株capan-1凋亡及Caspase-3信號通路的影響。方法 CCK-8檢測槐定堿對capan-1細(xì)胞活力的影響，Hoechest 33342染色法觀察細(xì)胞凋亡，分光光度法檢測Caspase-3的活性。結(jié)果與對照組比較，槐定堿能明顯抑制capan-1細(xì)胞生長(P<0.05)，促進(jìn)capan-1細(xì)胞凋亡(P<0.05)，上調(diào)Caspase-3的活性(P<0.05)。結(jié)論 槐定堿抑制capan-1細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡與下調(diào)Caspase-3的活性相關(guān)。

胰腺癌；capan-1；槐定堿；Caspase-3

槐定堿(sophoridine,SR)為中藥苦豆子(sophora alopecuroides)中有效活性成分之一[1]，對絨癌、惡性葡萄胎等惡性滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤具有較好的抑制作用[2]。研究證實(shí)Caspase-3信號通路在多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中扮演著重要的角色[3]。本實(shí)驗(yàn)采用槐定堿對人胰腺癌細(xì)胞株capan-1誘導(dǎo)凋亡作用，通過分析Caspase-3活性及采用其抑制劑后細(xì)胞凋亡的變化，探討其具體作用機(jī)制。現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器 槐定堿(寧夏鹽池縣醫(yī)藥公司提供，批號：060630，純度>99%)。胎牛血清(杭州四季青生物技術(shù)公司，批號：140130)；CCK-8細(xì)胞活力檢測試劑盒(日本Dojindo)；DMEM培養(yǎng)基(Dulbeco′s modified eagle medium,DMEM)(美國Hyclone公司，批號：NAE1396)；Hoechst33342 熒光染料(碧云天生物技術(shù)有限公司，批號：1022)；Caspase-3活性檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號：20140312)；Ac-DEVD-CHO(南京凱基生物公司，批號：20140914)；TE2000型倒置熒光顯微鏡(日本Nikon公司)；ST-360酶標(biāo)儀(上?？迫A實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)有限公司)。

1.2 方法 capan-1細(xì)胞株由漯河醫(yī)專分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室傳代保種，用含10%胎牛血清的 DMEM培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，用 0.25%的胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(eathylene diamine tetraacetic acid，EDTA)消化?；倍▔A采用DMEM溶解至20 g·L-1，保存于-20 ℃ ，備用。

1.2.1 細(xì)胞活力檢測 取對數(shù)期密度為1×104個·mL-1capan-1細(xì)胞懸液100 μL接種于96孔板，貼壁后24 h同步化，棄上清。參考前期[4]研究選擇設(shè)立SR2.5 g·L-1組、SR5 g·L-1組、抑制劑+SR5 g·L-1組(簡稱抑制組)及對照組，對照組加10%胎牛血清的DMEM的培養(yǎng)基，SR2.5 g·L-1組和SR 5 g·L-1組分別加濃度為2.5 g·L-1、5 g·L-1槐定堿且含10%胎牛血清的 DMEM培養(yǎng)基，抑制劑+SR 5 g·L-1組加含10%胎牛血清、5 g·L-1槐定堿及100 μmol·L-1的Ac-DEVD-CHO的DMEM的培養(yǎng)基，陰性對照組給予等量培養(yǎng)液，每組設(shè)置3個復(fù)孔，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)48 h，加入CCK-8 10 μL/孔孵育2 h，酶標(biāo)儀于570 nm檢查光密度值，計算細(xì)胞活力。

1.2.2 capan-1細(xì)胞凋亡觀察 采用Hoechest 33342染色法，參照“1.2.1”法設(shè)置各組，37 ℃、5%CO2溫箱培養(yǎng)48 h后，棄去上清，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline,PBS)清洗3次，每孔加入Hoechest 33342染色液10 μL，4 ℃，避光染色5 min，倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)變化，并計數(shù)凋亡細(xì)胞，計算凋亡率。

1.2.3 分光光度法檢測Caspase-3活性 參照“1.2.1”法設(shè)置各組。細(xì)胞培養(yǎng)48 h后終止培養(yǎng)，0.05%胰酶消化并收集細(xì)胞，PBS洗滌1次，按照每200萬細(xì)胞50 μL的比例加入裂解液，冰浴裂解30 min，4 ℃12 000 r·min-1離心15 min，取上清，0.05%胰酶消化收集細(xì)胞, Bradford法測定蛋白的量，取50 μL含150 μg蛋白的細(xì)胞裂解上清，加入50 μL 2×反應(yīng)液和5 μL Ac-DEVD-pNA，37 ℃避光孵育4 h，酶標(biāo)儀在波長400 nm檢測測定吸光度值。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞活性檢測 與對照組比較，2.5 g·L-1、5 g·L-1槐定堿能明顯降低capan-1細(xì)胞活力(P<0.05)。抑制組細(xì)胞活力明顯高于SR5 g·L-1組(P<0.05)，見圖1。

①與對照組比較，P<0.05，②與抑制組比較，P<0.05。圖1 SR對capan-1活力的影響

2.2 capan-1細(xì)胞凋亡觀察 圖2顯示，對照組細(xì)胞包膜完整，細(xì)胞核形態(tài)比較規(guī)則,細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)著色較深，發(fā)光均勻，呈現(xiàn)正常的藍(lán)色。抑制組出現(xiàn)部分細(xì)胞破碎和少量的凋亡小體。SR組細(xì)胞核致密濃染，部分顏色發(fā)白，而SR5 g·L-1組部分細(xì)胞的細(xì)胞核碎裂，產(chǎn)生較多凋亡小體。

圖2 capan-1細(xì)胞凋亡觀察(Hoechet 33342, ×200)

2.3 細(xì)胞凋亡率和Caspase-3活性的比較 與對照組比較，抑制組細(xì)胞capan-1細(xì)胞凋亡率和Caspase-3活性明顯升高，均有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)；與抑制組比較，SR2.5 g·L-1組、SR5 g·L-1組capan-1細(xì)胞凋亡率和Caspase-3活性明顯高于抑制組，均有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，見圖3-4。

圖3 細(xì)胞凋亡率的比較

①與對照組比較，P<0.05；②與抑制組比較，P<0.05。圖4 Caspase-3活性的比較

3 討論

胰腺癌為常見的惡性腫瘤，病死率較高，目前手術(shù)治療為主，輔以放療、化療及中醫(yī)療法等多種方法，但治療后的復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率依然沒有得到有效控制?；倍▔A是一種生物堿類活性成分，對癌細(xì)胞具有直接殺傷作用，且毒性較低[5]。本研究采用CCK-8法比較了槐定堿對胰腺癌細(xì)胞株capan-1活力的影響，結(jié)果表明，槐定堿有可能通過上調(diào)Caspase-3活性來抑制capan-1的活力，并促進(jìn)了胰腺癌細(xì)胞株capan-1凋亡，產(chǎn)生碎片或變小?；倍▔A與Caspase-3活力抑制劑聯(lián)用時，槐定堿對capan-1的活力和凋亡的影響能力明顯減弱，可能是由于抑制劑抑制capan-1細(xì)胞中Caspase-3信號通路，拮抗槐定堿通過線粒體路徑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，同時降低capan-1的活力。

研究顯示，胰腺癌的發(fā)生與細(xì)胞凋亡失衡有關(guān)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡可以有效地治療腫瘤[6]。本研究采用Hoechst33342染色顯示，不同質(zhì)量濃度的槐定堿作用后，部分細(xì)胞核發(fā)生碎裂，核染色質(zhì)呈分葉、碎片狀，提示槐定堿可能通過某種方式誘導(dǎo)并促進(jìn)了胰腺癌細(xì)胞株capan-1凋亡。Caspase-3是Caspase家族重要成員之一，在多種刺激物誘導(dǎo)的凋亡中起到關(guān)鍵作用，為細(xì)胞凋亡的執(zhí)行蛋白。一般而言，細(xì)胞在凋亡信號的刺激下，通過各種凋亡信號啟動級聯(lián)反應(yīng)，其中proCasepase-3斷裂產(chǎn)生具有活性的Cleaved Caspase-3，裂解多聚(ADP-核糖)聚合酶，同時誘發(fā)線粒體產(chǎn)生細(xì)胞色素C，并啟動后續(xù)的線粒體凋亡。本研究結(jié)果顯示，2.5 g·L-1、5 g·L-1槐定堿作用于capan-1細(xì)胞后，Caspase-3活性明顯升高，細(xì)胞凋亡率明顯增加，加入Caspase-3抑制劑后，capan-1細(xì)胞凋亡率明顯降低，提示槐定堿通過Caspase-3途徑誘導(dǎo)線粒體路徑細(xì)胞凋亡。但在此過程中，槐定堿capan-1細(xì)胞線粒體功能的影響還有待進(jìn)一步研究。

總之，槐定堿能通過調(diào)節(jié)Caspase-3信號通路中Caspase-3的表達(dá)水平，促進(jìn)capan-1細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮較好的抗腫瘤效果。

[1] 許婷,嚴(yán)祥.苦豆子生物堿對消化系統(tǒng)炎性疾病的影響[J].國際消化病雜志,2015,53(1):52-54.

[2] 閆德祺,閆英男,阿力木·買買提,等.苦參活性成分的抗腫瘤作用機(jī)制研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2014,14(24):4776-4779.

[3] Carlisi D,D′Anneo A,Angileri L,et al.Parthenolide sensitizes hepatocellular carcinoma cells to TRAIL by inducing the expression of death receptors through inhibition of STAT3 activation[J].J Cell Physiol,2011,226(6):1632-1641.

[4] 任麗平,李先佳,金少舉.槐定堿對人胰腺癌細(xì)胞株capan-1增殖及侵襲能力的影響[J].河南科技大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版),2016,34(4):244-246.

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[6] 馬佳,方斌斌,曾凡鵬,等.葡萄籽原花青素下調(diào)miR-27a表達(dá)抑制胰腺癌細(xì)胞生長[J].中南大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版),2015,40(1):46-52.

Effect of Sophoridine on Apoptosis of Human Pancreatic Cancer Cell Line Capan-1 by Caspase-3 Signaling Pathway

REN Li-ping1, LI Xian-jia2, JIN Shao-ju1

(1.Department of Pharmacology,Luohe Medical College,Luohe 462002,China; 2.Department of Biochemistry,Luohe Medical College,Luohe 462002,China)

ObjectiveTo investigate the effects of sophoridine on apoptosis of human pancreatic cancer cell line capan-1 by Caspase-3 signaling pathway.MethodsCCK-8 was used to detect the effect of sophoridine on the viability of capan-1 cells. Apoptosis was observed by Hoechest 33342 staining. The expression of Caspase-3 was detected by spectrophotometry.ResultsCompared with the control group, sophoridine could significantly inhibit the growth of capan-1 cells(P<0.05), promote cell apoptosis(P<0.05), up-regulate the expression of Caspase-3(P<0.05).ConclusionSophoridine could inhibit the proliferation of capan-1 cells and promote cell apoptosis, which was related to the up-regulation of Caspase-3.

pancreatic cancer; capan-1; sophoridine; Caspase-3

1672-688X(2017)01-0001-03

10.15926/j.cnki.issn1672-688x.2017.01.001

2.河南省高等學(xué)校重點(diǎn)科研資助項(xiàng)目(16B310004)

2016-01-17

1.漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校藥理教研室，河南漯河 462002 2.漯河醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校生化教研室，河南漯河 462002

任麗平(1984—)，女，河南舞陽人，講師，從事腫瘤藥理學(xué)研究。

金少舉，博士，副教授，E-mail：37050573@qq.com

R966;R735.9

A

1.河南省科技攻關(guān)計劃(社會發(fā)展領(lǐng)域)(162102310596)

3.漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校2016年度校級研究資助計劃 項(xiàng)目(2016-S-LMC-13)