力竭運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠腎小管凋亡和缺氧誘導(dǎo)因子-1α表達(dá)的影響及人參總皂苷干預(yù)研究

王會(huì)玲，李燕，田軍，胡偉鋒，張金元

高強(qiáng)度軍事訓(xùn)練或過(guò)度運(yùn)動(dòng)可能導(dǎo)致急性腎損傷(exercise-induced acute kidney injury，EIAKI)[1]。EIAKI指因劇烈運(yùn)動(dòng)或體能訓(xùn)練后，短時(shí)間內(nèi)引起的非創(chuàng)傷性血尿、蛋白尿或腎功能異常[2]。軍隊(duì)新兵入伍訓(xùn)練、大學(xué)入學(xué)新生體能訓(xùn)練或運(yùn)動(dòng)員馬拉松長(zhǎng)跑等，均容易出現(xiàn)EIAKI。EIAKI是軍事醫(yī)學(xué)、運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)面臨的亟待解決的問(wèn)題之一。EIAKI發(fā)生機(jī)制尚待闡明，目前認(rèn)為主要與短時(shí)間劇烈運(yùn)動(dòng)使機(jī)體血流動(dòng)力學(xué)發(fā)生改變，腎血流灌注相對(duì)不足，同時(shí)腎組織局部神經(jīng)內(nèi)分泌發(fā)生急劇變化，從而造成急性腎小管壞死有關(guān)[3]。我們既往研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)度運(yùn)動(dòng)可引起大鼠急性腎小管損傷，使腎臟局部血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)升高及氧自由基生成增多，氧化應(yīng)激反應(yīng)在腎小管損傷中發(fā)揮重要作用；人參總皂苷具有一定的抗氧化應(yīng)激、改善腎損害的作用[4]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)對(duì)腎缺血損傷具有重要作用。HIF-1α在EIAKI病理生理過(guò)程中發(fā)揮何種作用，人參總皂苷是否通過(guò)HIF-1α影響腎小管損傷修復(fù)，值得進(jìn)一步研究。因此，本研究探討人參總皂苷對(duì)力竭運(yùn)動(dòng)大鼠腎臟腎小管上皮細(xì)胞(tubular epithelial cells，TEC)凋亡以及腎組織HIF-1α表達(dá)的影響，以期為人參總皂苷防治EIAKI提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及試劑 雄性SD大鼠35只，體重350±10g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[合格證號(hào)：SCXF(滬)2010-0005]，SPF級(jí)。人參總皂甙(南京替斯艾么中藥研究所)?？捡R斯亮藍(lán)(美國(guó)Bio-Rad公司)；細(xì)胞凋亡試劑盒(美國(guó)Chemicon ApopTag S7100)；抗體Cleaved-Caspases-3(美國(guó)Santa Cruz公司)，HIF-1α(美國(guó)Cell signaling公司)，熒光二抗(Alexa Fluor 680/800，Invitrogen公司)，Cell Lytic MT組織裂解液(Sigma公司)，Odyssey遠(yuǎn)紅外激光掃描儀(LiCor公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 35只大鼠在本實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性飼養(yǎng)2d后，隨機(jī)分為5組：安靜對(duì)照組(CTL，n=7)、模型組[再分為2h組(M2，n=7)及24h組(M24，n=7)]、人參總皂苷干預(yù)組[再分為2h組(G2，n=7)及24h組(G24，n=7)]。G2和G24組于運(yùn)動(dòng)前5d給予人參總皂苷100mg/(kg·d)灌胃，1次/d；M2、M24和CTL組給予等體積蒸餾水灌胃，共5d。

1.3 造模方法及標(biāo)本收集 跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)：大鼠首先以10～15m/min速度進(jìn)行適應(yīng)性跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)15min，跑臺(tái)坡度0°；然后使其在30°坡度以25m/min速度持續(xù)運(yùn)動(dòng)45min或力竭。力竭標(biāo)準(zhǔn)：大鼠不能堅(jiān)持本負(fù)荷跑速，先后滯留跑道3次以上，行為表現(xiàn)為俯臥位、垂頭、呼吸幅度大，對(duì)刺激無(wú)反應(yīng)。力竭游泳方法：動(dòng)物休息10min后，置于水深55cm、水溫30±2℃的泳池中進(jìn)行力竭游泳，以大鼠3次沉沒(méi)于水中超過(guò)10s，且放在平面上無(wú)法完成翻正反射為力竭，然后將大鼠用電吹風(fēng)機(jī)吹干入籠。CTL組動(dòng)物在相同條件下常規(guī)飼養(yǎng)，不參與跑臺(tái)及游泳運(yùn)動(dòng)。記錄各組力竭運(yùn)動(dòng)后滯留跑道動(dòng)物數(shù)目以及力竭游泳時(shí)間。運(yùn)動(dòng)后2、24h后分別處死7只大鼠并采集標(biāo)本：10%水合氯醛麻醉，斷頭采血，打開(kāi)腹腔，暴露腎臟，經(jīng)0.9%氯化鈉溶液灌注，留取雙腎，左腎切片2mm厚，置于10%甲醛固定，右腎置于–80℃保存待測(cè)。

1.4 腎組織病理學(xué)觀察 腎組織經(jīng)脫水、石蠟包埋，切片3μm，常規(guī)HE染色，光鏡下觀察并攝片。

1.5 TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 腎臟組織標(biāo)本石蠟包埋，切片厚4μm，常規(guī)脫蠟至水，2%過(guò)氧化氫于室溫反應(yīng)5min，加入過(guò)氧化物酶(TdT酶)緩沖液，室溫1～5min，加TdT酶反應(yīng)液，置濕盒中于37℃反應(yīng)1h，加脫氧核糖核苷酸衍生物地高辛[(digoxigenin)-11-dUTP]30min，洗滌，DAB顯色，甲基綠復(fù)染，二甲苯脫水、干燥、封固。光鏡下觀察細(xì)胞核顯示為棕黃色顆粒為陽(yáng)性凋亡細(xì)胞。每張切片隨機(jī)選取10個(gè)以上腎皮髓質(zhì)交界處高倍視野，計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞核數(shù)目，并取平均數(shù)進(jìn)行分析。

1.6 免疫組化檢測(cè)Caspases-3、HIF-1α的表達(dá) 石蠟切片4μm厚，常規(guī)脫蠟至水，采用ABC法操作常規(guī)進(jìn)行，以PBS代替一抗為陰性對(duì)照，陽(yáng)性呈深棕色。一抗工作濃度：Caspase-3為1:50，HIF-1α為1:100。采用朗珈軟件分析系統(tǒng)，高倍下測(cè)量免疫組化陽(yáng)性區(qū)域面積(Area)和光密度(A)值，計(jì)算免疫組化指數(shù)(IHCP=Area×A)。

1.7 Western blotting檢測(cè)Caspases-3、HIF-1α的表達(dá) 提取總蛋白，考馬斯亮藍(lán)檢測(cè)蛋白濃度，10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜，加入Caspases-3、HIF-1α一抗，4℃過(guò)夜；洗膜，加入熒光二抗，孵育30min；洗膜后，Odyssey激光成像掃描。Caspases-3、HIF-1α的蛋白表達(dá)量用內(nèi)參照GAPDH進(jìn)行校正。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 14.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以s表示，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 一般情況及力竭游泳時(shí)間 大鼠運(yùn)動(dòng)前精神飽滿、目光有神、對(duì)刺激反應(yīng)靈敏；運(yùn)動(dòng)早中期，大鼠可跟上跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)速度和坡度的變化，運(yùn)動(dòng)后期因疲勞而滯留跑道；力竭游泳后，大鼠全身癱軟、目光黯淡無(wú)神、對(duì)周?chē)碳し磻?yīng)淡漠。與CTL組比較，模型組(n=14)大鼠跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)時(shí)，11只出現(xiàn)力竭滯留跑道，力竭游泳時(shí)間明顯縮短(11.32±3.63min)；與模型組比較，人參總皂苷組(n=14)大鼠耐力明顯增強(qiáng)，僅6只出現(xiàn)力竭，力竭游泳時(shí)間顯著延長(zhǎng)(19.59±8.26min)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.2 TEC細(xì)胞凋亡 石蠟切片上凋亡細(xì)胞核質(zhì)呈棕黃色熒光染色陽(yáng)性，或染色不均呈半月形，或形成凋亡小體，濃縮的核質(zhì)緊貼于核膜。CTL組腎組織僅見(jiàn)少許陽(yáng)性細(xì)胞。模型組在過(guò)度運(yùn)動(dòng)后2h凋亡數(shù)目即增加，M2組可見(jiàn)較多陽(yáng)性細(xì)胞，主要分布于皮髓質(zhì)交界處的TEC，髓質(zhì)腎小管和集合管也可見(jiàn)陽(yáng)性著色；M24組的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目明顯增加。G2、G24組的凋亡陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目較M2、M24組明顯減少(圖1)。

圖1 TUNEL法檢測(cè)大鼠TEC細(xì)胞凋亡(×40)Fig.1 Apoptosis of tubular epithelial cells detected by TUNEL(×40)

2.3 Caspases-3及HIF-1α在腎組織的分布及表達(dá)免疫組化檢測(cè)顯示，Caspases-3陽(yáng)性呈棕黃色顆粒散在分布于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，在損傷壞死較明顯的部位，可呈深棕色濃染。Caspases-3陽(yáng)性表達(dá)以皮髓質(zhì)交界處TEC最為明顯，髓質(zhì)的腎小管和集合管可見(jiàn)散在分布，與凋亡細(xì)胞分布一致，腎小球幾乎無(wú)表達(dá)。CTL組僅見(jiàn)個(gè)別腎小管弱陽(yáng)性淡染；模型M2組的表達(dá)較CTL組增強(qiáng)，M24組的表達(dá)明顯升高，在刷狀緣脫落的腎小管處呈顆粒樣強(qiáng)陽(yáng)性著色。與模型組比較，人參總皂苷干預(yù)后G2、G24組的Caspases-3陽(yáng)性表達(dá)均較M2、M24組明顯下降。HIF-1α陽(yáng)性也主要表達(dá)于皮髓質(zhì)交界處TEC，CTL組腎組織幾乎未見(jiàn)HIF-1α陽(yáng)性表達(dá)，模型M2、M24組的表達(dá)較CTL組明顯增強(qiáng)，在損傷腎小管周?chē)奈⑿⊙芸沙蕪?qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。與模型組比較，人參總皂苷干預(yù)G2、G24組的HIF-1α陽(yáng)性表達(dá)水平較M2、M24組更顯著，在損傷小管陽(yáng)性表達(dá)明顯，少許腎小球也有表達(dá)，G24組的表達(dá)也維持在較高水平(圖2)。

2.4 腎組織Caspases-3、HIF-1α蛋白的表達(dá)水平Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，CTL組僅有微量Caspases-3和HIF-1α蛋白表達(dá)，模型組Caspases-3顯著上調(diào)，M2組上調(diào)約2.7倍、M24組上調(diào)約3.0倍；而人參皂苷干預(yù)組的Caspases-3表達(dá)水平較CTL組明顯升高，但與模型組比較則呈一定程度下調(diào)，G2、G24組分別較M2、M24組下調(diào)約58%、61%(圖3A)。M2組HIF-1α表達(dá)水平上調(diào)約2.8倍，M24組上調(diào)約2.2倍(P＜0.01)；人參總皂苷G2組的HIF-1α表達(dá)與CTL組比較上調(diào)4.6倍，與M2組比較上調(diào)約1.6倍；G24組的HIF-1α表達(dá)較CTL組上調(diào)3.7倍，較M24組上調(diào)約1.5倍，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01，圖3B)。

圖2 免疫組化檢測(cè)大鼠腎組織Caspases-3及HIF-1α表達(dá)(×40)Fig.2 The expression of caspases-3 and HIF-1α in rat' kidney detected by immunohistochemistry(×40)

圖3 腎組織Caspases-3(A)及HIF-1α(B)蛋白表達(dá)水平(Western blotting)Fig.3 Protein expression of caspases-3 (A) and HIF-1α (B) in rat' kidney detected by Western blotting

3 討 論

運(yùn)動(dòng)與腎臟損傷的關(guān)系尚待明確。一般認(rèn)為低強(qiáng)度耐力訓(xùn)練對(duì)機(jī)體的應(yīng)激性刺激較小，而高強(qiáng)度過(guò)度運(yùn)動(dòng)可損傷機(jī)體，產(chǎn)生疲勞甚至過(guò)度疲勞，成為不良刺激因素而產(chǎn)生損害。研究發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)可引起健康人群尿蛋白排泄明顯增加，馬拉松運(yùn)動(dòng)后1h尿白蛋白排泄率從15μg/min上升至316μg/min；腎血流量可下降31%，腎小球?yàn)V過(guò)率也有輕微降低，尿中腎損害標(biāo)志物中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin，NGAL)升高7.7倍[5]。輕中度運(yùn)動(dòng)量引起腎小球性蛋白尿(尿白蛋白)增加，而高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)可使腎小管性蛋白尿(β2微球蛋白)排泄增加[6]。EIAKI的腎損傷機(jī)制不明，目前認(rèn)為氧化應(yīng)激損傷可能是過(guò)度運(yùn)動(dòng)致腎損傷的主要機(jī)制。短時(shí)間高強(qiáng)度超負(fù)荷的運(yùn)動(dòng)，影響機(jī)體血流動(dòng)力學(xué)，使腎臟組織供血急劇減少，形成運(yùn)動(dòng)性腎缺血，而運(yùn)動(dòng)后隨著腎臟血供恢復(fù)，可形成缺血性再灌注，導(dǎo)致腎臟局部氧化應(yīng)激反應(yīng)加劇，氧自由基活性增強(qiáng)，從而造成對(duì)腎細(xì)胞的實(shí)質(zhì)性損害，主要表現(xiàn)為皮髓交界部的腎小管發(fā)生細(xì)胞凋亡[7]。

細(xì)胞凋亡是早期腎損傷細(xì)胞死亡的主要形式，在多種腎病模型中均觀察到腎組織細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，Caspase-3作為關(guān)鍵執(zhí)行分子，是細(xì)胞凋亡性死亡的最終執(zhí)行者[8-9]。文獻(xiàn)報(bào)道高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)可使腎臟局部脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)增強(qiáng)，對(duì)細(xì)胞生物膜產(chǎn)生毒害作用，同時(shí)引起皮髓質(zhì)血管緊張素Ⅱ水平升高，誘導(dǎo)腎組織凋亡[8,10]；大鼠游泳至力竭可導(dǎo)致明顯的腎組織細(xì)胞凋亡，力竭后24h在腎組織皮髓質(zhì)交界處及髓質(zhì)腎小管和集合管，可見(jiàn)大量散在成片狀分布的凋亡細(xì)胞，并可能通過(guò)破壞TEC的Bax/Bcl-2信號(hào)平衡，激活Caspases-3依賴(lài)的凋亡信號(hào)通路，進(jìn)而誘導(dǎo)TEC凋亡[11-12]。

人參總皂苷是中藥人參的提取物，具有提高機(jī)體免疫力、抗衰老、減輕組織器官的缺血再灌注損傷，減輕細(xì)胞內(nèi)鈣超負(fù)荷、抗細(xì)胞凋亡等作用[13]。研究提示，人參總皂苷可減輕細(xì)胞線粒體的損傷、改善缺氧組織的能量代謝，保護(hù)缺血損害時(shí)細(xì)胞膜及其亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，對(duì)缺血性腎衰竭腎臟具有明顯的保護(hù)作用[14-15]。我們通過(guò)跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)及力竭游泳方法制作大鼠EIAKI模型，應(yīng)用TUNEL法檢測(cè)腎固有細(xì)胞凋亡情況，發(fā)現(xiàn)模型組在過(guò)度運(yùn)動(dòng)后2h皮髓質(zhì)交界處TEC凋亡數(shù)目即增加，24h后凋亡細(xì)胞明顯增加；而人參總皂苷干預(yù)治療后，上述陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目明顯下降，證明人參總皂苷可改善細(xì)胞EIAKI引起的TEC凋亡，結(jié)果提示過(guò)度運(yùn)動(dòng)加力竭游泳可引起腎小管上皮損傷，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，人參總皂苷可改善細(xì)胞凋亡。對(duì)腎組織免疫組化分析顯示，過(guò)度運(yùn)動(dòng)后造成腎小管局部損傷，凋亡關(guān)鍵信號(hào)蛋白Caspases-3表達(dá)增強(qiáng)，24h時(shí)在刷狀緣脫落的小管處呈顆粒樣強(qiáng)陽(yáng)性著色；而人參總皂苷干預(yù)G2、G24組的Caspases-3陽(yáng)性表達(dá)均較M2、M24組明顯下降。Western blotting檢測(cè)結(jié)果也顯示，模型組Caspases-3蛋白表達(dá)水平在2、24h逐漸上調(diào)，提示人參總皂苷可通過(guò)下調(diào)Caspases-3依賴(lài)的凋亡信號(hào)，抑制TEC凋亡，從而保護(hù)過(guò)度運(yùn)動(dòng)后的腎損傷。

HIF-1α是介導(dǎo)缺氧適應(yīng)性反應(yīng)的細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子，廣泛參與氧敏感特異性調(diào)控應(yīng)答，在低氧時(shí)迅速啟動(dòng)基因激活，并通過(guò)核移位和轉(zhuǎn)錄活化、蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)等發(fā)揮作用，使機(jī)體對(duì)缺血缺氧產(chǎn)生適應(yīng)性反應(yīng)，是缺氧誘導(dǎo)基因調(diào)控和修復(fù)細(xì)胞內(nèi)氧環(huán)境穩(wěn)定的核心調(diào)節(jié)因子[16-17]。HIF-1α高表達(dá)于TEC，其對(duì)急性腎損傷的保護(hù)作用近年來(lái)受到重視。Rosenberger等[18]對(duì)大鼠AKI模型的研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1α早期快速激活對(duì)腎臟在缺氧損傷中的反應(yīng)性保護(hù)具有重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)HIF-1α表達(dá)水平在模型組M2上調(diào)約2.8倍，在M24上調(diào)約2.2倍，這可能是機(jī)體對(duì)缺血缺氧的一種保護(hù)性反應(yīng)。人參總皂苷干預(yù)組HIF-1α在早期即快速上調(diào)，并持續(xù)高水平表達(dá)，提示人參總皂苷通過(guò)上調(diào)HIF-1α表達(dá)水平，減輕了腎組織的缺血缺氧損害，這可能是人參總皂苷改善腎損傷的重要機(jī)制之一，其影響環(huán)節(jié)有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，過(guò)度運(yùn)動(dòng)可導(dǎo)致大鼠TEC凋亡，Caspases-3表達(dá)水平上調(diào)；人參總皂苷可通過(guò)下調(diào)Caspases-3依賴(lài)的凋亡信號(hào)，快速上調(diào)HIF-1α表達(dá)水平，減輕TEC凋亡，從而保護(hù)過(guò)度運(yùn)動(dòng)后的腎損傷，這可能是人參總皂苷改善過(guò)度運(yùn)動(dòng)性腎損傷的重要機(jī)制之一。

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