膠質瘤干細胞與神經干細胞基因表達差異的微陣列基因芯片分析

尹豐，張劍寧，趙明明，周春輝，王淑為，郭欣如，劉爽

腦膠質瘤是成年人最常見的惡性腦腫瘤，盡管手術、放化療等傳統(tǒng)治療方法目前已有了很大改進，但惡性膠質瘤的預后仍不理想，特別是膠質母細胞瘤，患者平均生存期僅為14個月[1]。最近的研究顯示腦腫瘤中存在一小部分具有干細胞特性的細胞亞群，即腦腫瘤干細胞(BTSCs)，目前認為BTSCs是腦腫瘤發(fā)生發(fā)展的根源以及產生放化療抗性和腫瘤復發(fā)的原因[2-5]。研究顯示，BTSCs與神經干細胞(NSCs)具有許多相似的特性，如自我更新、多向分化及成瘤性等，提示BTSCs可能起源于突變的NSCs[6-8]。探討NSCs向膠質瘤干細胞(GSCs)惡性轉化的分子機制對于進一步明確膠質瘤的起源以及開發(fā)特異性的治療策略具有十分重要的意義。本研究采用含有29 186個人類mRNA探針的表達譜基因芯片對正常NSCs及GSCs中的差異表達基因進行對比篩查，并利用生物信息學方法對可能與NSCs向GSCs惡性轉化有關的信號分子及信號路徑進行預測，旨在為探索GSCs的起源及機制提供新的線索和方向。

1 材料與方法

1.1 人GSCs和NSCs的分離培養(yǎng)及鑒定 GSCs來源于新診斷的WHO Ⅳ級膠質母細胞瘤(GBM)患者手術切除的腫瘤組織。NSCs來源于10～13周自然流產胚胎的海馬組織。采用Neurosphere法體外培養(yǎng)擴增所獲GSCs和NSCs，在穩(wěn)定傳代的基礎上，對這兩種干細胞的表型特征和分化特性進行CD133和Nestin免疫化學染色鑒定，同時在裸鼠顱內進行定向移植試驗檢測兩種干細胞的體內成瘤性[9]。本研究經海軍總醫(yī)院倫理委員會審查批準，標本的獲取均經患者本人同意，患者了解所取標本的風險和用途，并簽署知情同意書。

1.2 差異表達基因的微陣列基因芯片分析 采用RNeasy Midi試劑盒(Qiagen公司，加拿大)提取GSCs和NSCs的總RNA，利用Human HOA5.1 OneArray(Phalanx Biotech Group，中國臺灣)對GSCs和NSCs的mRNA表達譜進行檢測。收集所得數據，利用Rosetta Resolved System (Rosetta Biosoftware公司，美國)進行分析，根據所得FC值(GSCs與NSCs中mRNA表達豐度的比值)確定差異表達基因，標準為FC≥2或≤0.5且P＜0.01。

1.3 qRT-PCR驗證 利用Trizol試劑分別提取體外培養(yǎng)的GSCs和NSCs中的總RNA，根據待測mRNA序列設計合成引物(表1)，利用SYBR Green 試劑盒(Applied Biosystems)進行qRT-PCR驗證，以β-actin作為內參。擴增程序為97℃ 3min；95℃變性30s，56℃退火20s，72℃延伸30s，40個循環(huán)。實驗重復3次。結果以2－ΔΔCt表示。

表1 實時定量RT-PCR的寡核苷酸引物Tab.1 Oligonucleotide primers in quantitative real-time RT-PCR

1.4 生物信息學分析 利用GO和KEGG富集分析研究差異表達基因可能參與的信號路徑。

1.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析，數據結果以表示，差異表達基因的比較采用結合方差分析(ANOVA)和倍數變化(fold change，FC)分析的方法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 GBM來源的GSCs的鑒定 無菌環(huán)境中分離GBM標本成單細胞懸液，無血清神經干細胞培養(yǎng)基體外培養(yǎng)7d，鏡下可見許多小的神經球。免疫熒光染色顯示CD133陽性。誘導分化后可形成膠質纖維酸性蛋白(GFAP)陽性的神經膠質細胞和β-tubulin陽性的神經元細胞。利用動物立體定向儀將這些神經球移植到裸鼠顱內可形成新的腦腫瘤(圖1)。

圖1 GSCs的體外培養(yǎng)及鑒定(×20)Fig. 1 Culture in vitro and identification of GSCs (×20)

2.2 GSCs與NSCs中差異表達基因的芯片檢測 微陣列基因芯片檢測顯示，與NSCs相比，GSCs中有1501個基因表達上調，1372個基因表達下調。表2顯示了差異表達最顯著的10個上調和下調基因。對2873個差異表達基因進行聚類分析，篩選條件為FC≥2或者≤1，調節(jié)P≤0.01，表達譜中最大值為6.166 69，最小值為－9.349 5，將每個mRNA在6個樣本中的最大值標準化為1，最小值轉化為0，如圖2。GO及KEGG分析顯示，在1372個下調基因中，錯誤發(fā)現率(FDR)＜0.01的富集的GO生物過程有139個，在1501個上調基因中，FDR＜0.01的富集的GO生物過程有62個。下調基因中，FDR＜0.01的KEGG信號路徑有5個，分別為神經軸突導向、細胞周期、細胞黏附、免疫炎癥反應及癌癥相關信號路徑(圖3)。

表2 GSCs中上調和下調最明顯的前10個基因Tab.2 Top 10 up-and down-regulated genes in GSCs

圖2 GSCs及NSCs中差異表達基因的聚類分析Fig. 2 Heatmaps depicting hNSC and hGSC mRNAs derived from t-test and FC analyses

2.3 qRT-PCR驗證 本研究選擇7個芯片檢測到的差異表達基因(DCX、PTGS2、SCGN、GAD2、OTX2、PEG10、NRXN3)進行qRT-PCR驗證，根據各自mRNA序列設計引物，以β-actin作為內參照。驗證結果顯示，所選的7個基因在GSCs與NSCs中均存在差異表達，且與芯片檢測結果相符(表3)，兩種方法檢測的一致率為100%。

表3 部分芯片檢測差異基因的實時定量RT-PCR驗證Tab.3 Assay of some of the differential genes by quantitative real-time RT-PCR

3 討 論

最近有研究顯示，膠質瘤中存在一小群稱為GSCs的、具有干細胞特性的細胞亞群，該細胞亞群來源于突變的NSCs[10-12]，是膠質瘤復發(fā)及放化療抗性的根源。為了進一步探索NSCs向GSCs惡性轉化的機制，本研究對GSCs和NSCs進行了表達譜基因芯片對比篩查，結果發(fā)現2873個差異表達基因。其中尼克酰胺N-甲基轉移酶(NNMT)在GSCs中的表達明顯高于NSCs，而有研究顯示NNMT在其他腫瘤細胞中也呈高表達，敲除NNMT能夠抑制腫瘤細胞的增殖和集落形成能力[13]，提示NNMT的異常表達可能參與了膠質瘤的發(fā)生與發(fā)展。相反，性別決定基因盒1(SOX1)在GSCs中的表達明顯低于NSCs，而本研究所采用的標本均來自男性，因此可以忽略性別因素的影響，從而推測SOX1表達缺失可能參與了NSCs向GSCs的惡性轉化。有研究證實肝癌細胞可通過啟動子的超甲基化而下調SOX1的表達，而過表達SOX1可抑制肝癌細胞的增殖、克隆形成及侵襲能力[14]。

圖3 對芯片檢測的差異表達基因的GO功能和KEGG信號路徑富集分析Fig. 3 The GO BP and KEGG signaling pathway analysis of differentially expressed genes

然而，本研究中一些差異表達基因的功能與已有的報道并不一致，如胰島素樣因子結合蛋白3(IGFBP3)在GSCs中的表達明顯高于NSCs，而Wu等[15]的研究顯示IGFBP3可通過活化caspases誘導多種腫瘤細胞的凋亡和細胞周期休止，提示同一種基因在不同的組織細胞中可能具有截然不同的功能和作用，盡管有些基因在其他腫瘤中的功能已被研究確定，但是在膠質瘤中的作用還有待于進一步深入探討。

總之，本研究揭示了GSCs與NSCs在mRNA表達水平的差異，提示由mRNA所控制的轉錄調節(jié)網絡對NSCs向GSCs的惡性轉化具有重要影響。該結果為探索膠質瘤發(fā)生發(fā)展機制提供了線索，為膠質瘤的診斷和靶向治療提供了新的靶點。

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