PTSD狀態(tài)下HCN2-GLT-1在脊髓水平協(xié)同調(diào)控內(nèi)臟高敏感性-中樞敏化的作用及機(jī)制研究

紀(jì)雷，陳強(qiáng)，何雨芩，林玲，冉亞梅，朗秀瓊，李磊，王建明，王正國，楊敏

創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙(post-traumatic stress disorder，PTSD)是指突發(fā)性、威脅性或?yàn)?zāi)難性事件導(dǎo)致個(gè)體延遲出現(xiàn)和長期持續(xù)存在的精神心理障礙[1-2]。既往研究證實(shí)，在PTSD狀態(tài)下存在著廣泛的內(nèi)臟敏感性的改變，即痛覺敏化/去敏化現(xiàn)象[3-4]，但其確切的分子機(jī)制尚不清楚。超極化激活環(huán)核苷酸門控陽離子通道(hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated，HCN)的研究起源于超極化激活電流(hyperpolarization-activated current，Ih)的發(fā)現(xiàn)，有4種亞型，分別為HCN1、HCN2、HCN3和HCN4[5]。其中HCN2廣泛分布于大腦、脊髓等神經(jīng)組織，對神經(jīng)元興奮性高低及疼痛的調(diào)節(jié)起重要作用[6]。既往對HCN2在疼痛領(lǐng)域的研究主要集中在軀體痛方面，但有關(guān)HCN2在慢性內(nèi)臟痛及應(yīng)激相關(guān)的內(nèi)臟高敏感性-中樞敏化中的作用及機(jī)制研究鮮見文獻(xiàn)報(bào)道。

既往研究表明，谷氨酸在參與脊髓水平傷害性信息的傳遞及痛覺過敏中發(fā)揮著重要作用，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)[7]。谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體-1(glutamate transporter-1，GLT-1)的激動劑頭孢曲松(ceftriaxone，CTX)可選擇性誘發(fā)編碼GLT-1的基因轉(zhuǎn)錄，GLT-1可通過調(diào)節(jié)谷氨酸在突觸前膜和突觸后膜受體的利用率，雙向調(diào)節(jié)突觸內(nèi)的谷氨酸水平及其功能活性，并可能通過影響HCN2離子通道的表達(dá)發(fā)揮抗傷害性刺激效應(yīng)[8]。另外，HCN2的阻斷劑(ZD7288)還可通過抑制突觸前的Ca2+內(nèi)流，調(diào)節(jié)突觸前遞質(zhì)的釋放[9-11]。為此，我們推測，在PTSD狀態(tài)下，HCN2-GLT-1在脊髓水平協(xié)同調(diào)控內(nèi)臟高敏感性-中樞敏化的形成中發(fā)揮了重要作用。本研究利用連續(xù)單一應(yīng)激(SPS)聯(lián)合足底電擊刺激建立PTSD內(nèi)臟高敏感大鼠模型，旨在闡明PTSD狀態(tài)下HCN2-GLT-1在脊髓水平協(xié)同調(diào)控內(nèi)臟高敏感性-中樞敏化的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 PTSD內(nèi)臟高敏感大鼠模型的建立及分組 選用清潔級成年雌性SD大鼠44只，體重150～200g，由第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供并經(jīng)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會審查通過。隨機(jī)分為3組：正常對照組(n=14)、PTSD內(nèi)臟高敏感模型組(PTSD組，n=15)、PTSD+CTX組(n=15)，每組中各有7只用于HCN2免疫熒光檢測，其余用于內(nèi)臟敏感性測定。正常對照組采用無干擾正常飼養(yǎng)；PTSD組按照文獻(xiàn)[12]的方法，采用SPS聯(lián)合足底電擊刺激建立內(nèi)臟高敏感大鼠模型，實(shí)驗(yàn)開始時(shí)將大鼠束縛2h，強(qiáng)迫游泳15min，休息15min，乙醚麻醉至意識喪失，清醒后給予1mA電擊，持續(xù)4s，應(yīng)激后7d開始實(shí)驗(yàn)。PTSD+CTX組除在PTSD術(shù)后給予CTX預(yù)處理(200mg/kg，腹腔注射)外，其余與PTSD組相同。

1.2 各組HCN2表達(dá)的免疫熒光檢測 給藥7d后的大鼠在深麻醉下用血管鉗提起胸骨柄，剪開胸腔，暴露心臟，使用鈍性針頭插入左心室至升主動脈根部后，用血管鉗固定；用0.01mol/L PBS溶液灌注，此時(shí)右心耳膨脹，用眼科剪小心剪開，讓PBS溶液將整個(gè)大鼠的全身血液沖洗干凈，直至肝臟顏色變白或從右心耳流出的液體變清為止，約需PBS溶液250ml。沖洗干凈后，立即灌入4%多聚甲醛溶液(pH 7.4)約250ml固定30min以上；灌注完畢立即用血管鉗咬開脊柱，取出脊髓腰段(L4－L6)，4%多聚甲醛浸泡固定過夜，30%蔗糖溶液脫水過夜，0.01mol/L PBS溶液清洗后連續(xù)冠狀切片，片厚25μm，以漂片法進(jìn)行HCN2的免疫熒光染色。具體步驟如下：0.01mol/L PBS充分漂洗3次；加入封閉用正常羊血清工作液(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，阻斷非特異性免疫反應(yīng)30min；加入一抗(兔抗HCN2，1:1000，Abcam公司)，于4℃孵育過夜；0.01mol/L PBS漂洗3次；加入熒光二抗(FITC，1:200，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)37℃孵育2h；0.01mol/L PBS漂洗3次；抗熒光淬滅封片劑(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)封片。采用BX50 Olympus顯微鏡及Leica TCS SP2激光共聚焦顯微鏡觀察并攝像，并采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)測量各組脊髓HCN2的平均光密度(A)值，表示HCN2的免疫熒光表達(dá)強(qiáng)度。

1.3 內(nèi)臟敏感性的測定 參考文獻(xiàn)[13]的方法，將大鼠按50mg/kg給予3%戊巴比妥腹腔注射麻醉，切開皮膚，將消毒電極埋植在一側(cè)腹股溝韌帶上方2cm處的腹外斜肌上，電極間隔約0.5～1.0cm，以絲線固定，電極另一端經(jīng)皮下隧道引至頸背部并用橡膠套管保護(hù)后固定于皮膚，恢復(fù)后開始用于實(shí)驗(yàn)。采用生物機(jī)能信號采集系統(tǒng)記錄結(jié)直腸擴(kuò)張(colorectal distention，CRD)-內(nèi)臟運(yùn)動反射(visceromotor reflex，VMR)，即通過CRD引起的腹外斜肌肌電活動(electromyogram，EMG)來評估內(nèi)臟敏感性改變。參照既往文獻(xiàn)[13]，大鼠內(nèi)臟敏感性測定前24h，禁食不禁水，在乙醚吸入麻醉下，將已埋植的電極與生物機(jī)能信號采集系統(tǒng)導(dǎo)線相連，由肛門插入擴(kuò)張氣囊，導(dǎo)管直徑為2mm，氣囊末端距肛門口約1cm，導(dǎo)管固定在鼠尾根部，待大鼠清醒并適應(yīng)環(huán)境30min后行梯度結(jié)直腸擴(kuò)張刺激(分別為10、20、40、60mmHg)。先以CRD壓力為0mmHg時(shí)記錄EMG 10s作為基線期，然后向球囊內(nèi)快速充氣，每一壓力重復(fù)注氣3次，維持20s，不同梯度壓力間隔5min。誘發(fā)的EMG通過置于腹外斜肌的電極引出后，經(jīng)放大、過濾和轉(zhuǎn)換后錄入計(jì)算機(jī)，使用SPIKE2分析軟件計(jì)算平均曲線下面積(area under the curve，AUC)以定量EMG，并計(jì)算擴(kuò)張期與基線AUC的差值，該AUC差值代表不同擴(kuò)張壓力的CRD誘導(dǎo)的VMR反應(yīng)的程度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用s表示，多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 PTSD狀態(tài)下HCN2表達(dá)的變化及CTX對HCN2表達(dá)的影響 免疫熒光檢測結(jié)果表明，與正常對照組比較，PTSD組脊髓HCN2表達(dá)明顯增高(78.05±6.49 vs 121.12±4.85，P＜0.001)；與PTSD組比較，PTSD+CTX組HCN2表達(dá)顯著降低(121.12±4.85 vs 98.24±5.86，P=0.012)；與正常對照組比較，PTSD+CTX組HCN2表達(dá)亦顯著升高(78.05±6.49 vs 98.24±5.86，P=0.024，圖1)。

2.2 PTSD狀態(tài)下內(nèi)臟敏感性的改變 PTSD組AUCVMR在CRD為10、20mmHg時(shí)，與正常對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在CRD為40、60mmHg時(shí)明顯高于正常對照組(P＜0.001)。PTSD+CTX組AUCVMR在CRD為20、40、60mmHg時(shí)，均明顯低于PTSD組(P＜0.01)，在CRD為40、60mmHg時(shí)，則明顯高于正常對照組(P＜0.01，表1)。

圖1 脊髓組織HCN2表達(dá)的免疫組化檢測(bar=250μm)Fig.1 HCN2 expression in spinal tissue (Immunohistochemistry, bar=250μm)

表1 不同CRD壓力下大鼠內(nèi)臟敏感性(AUCVMR值)比較(Tab.1 Comparison of visceral sensitivity (AUCVMR) of rats under different CRD

表1 不同CRD壓力下大鼠內(nèi)臟敏感性(AUCVMR值)比較(Tab.1 Comparison of visceral sensitivity (AUCVMR) of rats under different CRD

(1)P＜0.001 compared with control group; (2)P＜0.01 compared with PTSD group; (3)P＜0.01 compared with PTSD+CTX group

Group 10mmHg 20mmHg 40mmHg 60mmHg Control group (n=7) 0.0086±0.0011 0.2614±0.0150 0.3786±0.0155(3) 0.5271±0.0212(3)PTSD group (n=8) 0.0428±0.0057 0.2913±0.0229 0.6200±0.0278(1) 0.7663±0.0262(1)PTSD+CTX group (n=8) 0.0501±0.0050 0.2175±0.0090(2) 0.5038±0.0336(2) 0.6400±0.0245(2)

3 討 論

本研究采用SPS聯(lián)合足底電擊刺激成功建立了PTSD內(nèi)臟高敏感大鼠模型，本模型在第7天時(shí)大鼠的內(nèi)臟敏感性達(dá)到最高。本研究結(jié)果表明，在PTSD狀態(tài)下大鼠脊髓HCN2表達(dá)顯著上調(diào)，為HCN2參與應(yīng)激相關(guān)的內(nèi)臟高敏感性-中樞敏化的形成提供了形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)。另外，我們發(fā)現(xiàn)，在PTSD模型鼠脊髓前角運(yùn)動神經(jīng)元上也有大量HCN2的表達(dá)，可能與機(jī)械性痛敏和運(yùn)動功能相關(guān)。GLT-1激動劑CTX可選擇性誘發(fā)編碼GLT-1的基因轉(zhuǎn)錄，同時(shí)可明顯下調(diào)HCN2的表達(dá)，共同發(fā)揮抗內(nèi)臟傷害性刺激的效應(yīng)，提示在PTSD狀態(tài)下HCN2-GLT-1可協(xié)同調(diào)控內(nèi)臟高敏感性-痛覺敏化的形成。

既往研究表明，HCN2通道在炎性痛和神經(jīng)病理性痛模型大鼠初級感覺神經(jīng)元中的表達(dá)水平顯著升高，并且在PGE2等因子的影響下，使脊髓背角神經(jīng)元的興奮性提高并導(dǎo)致神經(jīng)元異常放電，而HCN2基因敲除則能明顯減輕神經(jīng)病理性/炎性疼痛模型小鼠的痛行為及痛敏狀態(tài)，機(jī)械性誘發(fā)痛和熱痛覺過敏明顯減輕[14-15]，提示HCN2通道在異常疼痛的發(fā)生及維持中發(fā)揮重要作用。本研究亦表明，在PTSD狀態(tài)下HCN2在脊髓水平表達(dá)明顯上調(diào)，其調(diào)控內(nèi)臟高敏感性-中樞敏化形成的主要機(jī)制可能為：①通過HCN2介導(dǎo)Ih發(fā)揮作用。Ih是一種電壓依賴性陽離子電流，它決定著神經(jīng)元的靜息膜電位高低及調(diào)控動作電位，還介導(dǎo)不同神經(jīng)元神經(jīng)沖動的節(jié)律性發(fā)放。有研究表明，神經(jīng)損傷后，表達(dá)Ih的神經(jīng)元比例明顯升高，同時(shí)其Ih的電流激活曲線向去極化方向平移，半激活電位明顯去極化，誘使Ih的電流活性增強(qiáng)[16]，從而提示HCN2介導(dǎo)的Ih電流可能是調(diào)控PTSD狀態(tài)下內(nèi)臟高敏感性-中樞敏化形成的主要機(jī)制之一。②與GLT-1的協(xié)同調(diào)控作用。目前有關(guān)GLT-1-HCN2相互作用的確切分子機(jī)制尚不清楚，可能與GLT-1通過調(diào)節(jié)谷氨酸在突觸前膜和突觸后膜受體的利用率，雙向調(diào)節(jié)突觸內(nèi)的谷氨酸水平，進(jìn)而影響HCN2離子通道的表達(dá)有關(guān)。另外，既往研究亦證實(shí)[9-11]，HCN2的阻斷劑(ZD7288)可劑量依賴性抑制神經(jīng)元谷氨酸釋放及谷氨酸誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)鈣增加，從而抑制突觸前Ca2+內(nèi)流，調(diào)節(jié)突觸前遞質(zhì)的釋放。本研究表明，在PTSD狀態(tài)下，采用CTX選擇性誘發(fā)編碼GLT-1的基因轉(zhuǎn)錄后，HCN2的表達(dá)明顯下調(diào)，提示CTX可通過下調(diào)脊髓HCN2的表達(dá)參與調(diào)節(jié)內(nèi)臟高敏感性-痛覺敏化的形成；另外，CTX還可通過上調(diào)GLT-1的表達(dá)減少谷氨酸累積[7]，協(xié)同發(fā)揮抗傷害性內(nèi)臟刺激作用。

總之，本研究表明，PTSD狀態(tài)下脊髓水平HCN2通道表達(dá)發(fā)生了改變，采用CTX選擇性誘發(fā)編碼GLT-1的基因轉(zhuǎn)錄可影響HCN2的表達(dá)，提示PTSD狀態(tài)下HCN2-GLT-1在脊髓水平具有協(xié)同調(diào)控內(nèi)臟高敏感性-中樞敏化的作用。有效調(diào)控HCN2-GLT-1信號通路，可為防止或抑制PTSD及內(nèi)臟高敏感性-痛覺敏化相關(guān)疾病的形成和發(fā)展提供新的治療靶點(diǎn)。

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