不同產(chǎn)地顯齒蛇葡萄中二氫楊梅素測定

王家勝，何磊磊，張 妮，孔 琪，玉秋萍，余正文(貴州師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽 550001)

顯齒蛇葡萄Ampelopsis grossedentata(Hand.-Mazz.)W.T.Wang［1］富含黃酮化合物，主要分布在武夷山、羅霄山、南嶺、武陵山等山地地區(qū)，閩、贛、湘、粵、桂、鄂、黔等省各自均為廣泛分布區(qū)。其嫩莖葉經(jīng)揉制、干燥，即為民間 (土家族、瑤族)特色茶飲。產(chǎn)品多為白霜 (二氫楊梅素)覆裹，揉制恰當(dāng)則可呈現(xiàn)綠茶色澤，茶葉有卷曲狀、團(tuán)狀、餅狀等，不少茶廠的產(chǎn)品常輔以葉柄、嫩莖等，市場常見藤茶、莓茶、客家白茶等多種名稱。

顯齒蛇葡萄的主要活性成分為二氫楊梅素［2］，其干葉中二氫楊梅素含有量高達(dá)40%［3］。中國顯齒蛇葡萄資源豐富，但各產(chǎn)區(qū)植株的二氫楊梅素含有量尚無系統(tǒng)性數(shù)據(jù)。本研究以超聲波輔助提取、HPLC法檢測的方法［4］，獲得不同產(chǎn)地顯齒蛇葡萄中二氫楊梅素含有量數(shù)據(jù)，分析各地顯齒蛇葡萄的資源特點。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 植物原料于2013年5月3日—20日采自江西省、湖南省、湖北省、貴州省、廣西省、廣東省不同鄉(xiāng)鎮(zhèn)。不同植株的采點間隔不小于200 m，單株葉片約200 g作為一個樣品，自然晾干，裝袋。

二氫楊梅素對照品為實驗室自制，純度大于98%;甲醇和乙腈為色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品，其余試劑均為分析純。

試驗儀器和設(shè)備主要有KQ-500DE型超聲波清洗器 (昆山市超聲儀器有限公司)，分析天平 (十萬分之一，梅特勒-托利多儀器有限公司)，多功能粉碎機LX-02(上海江信科技有限公司);Agilent 1200LC(美國安捷倫科技有限公司);Dikma色譜柱 (250 mm×4.60 mm，5 μm，中國迪馬公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 色譜條件 進(jìn)樣量10 μL;紫外檢測波長292 nm;柱溫40℃;流動相為0.1%磷酸-甲醇-乙腈梯度洗脫 (0～10 min，74.4∶8∶17.6;10～15 min，36∶20 ∶44;15.1～18 min，74.4 ∶8 ∶17.6);體積流量1 mL/min。

1.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取二氫楊梅素100.00 mg，置于100 mL棕色量瓶中，以甲醇溶解并稀釋到刻度，搖勻，得到質(zhì)量濃度為1.00 mg/mL的二氫楊梅素對照品溶液，分別量取1.0、2.0、4.0、5.0、8.0、10.0 mL，甲醇定容至 10 mL，得系列對照品溶液。

1.2.3 供試品溶液制備 樣品于50℃烘干，取30.0 g干樣，粉碎45 s，過40目 (0.42 mm)篩。差量法稱取樣品0.1000 g于10 mL量瓶中，甲醇定容，浸泡12 h，100 kHz超聲輔助提取60 min后冷卻，取2 mL濾液用甲醇定容到10 mL，過0.22 μm濾膜，得到供試品溶液。

1.2.4 線性關(guān)系考察 對照品溶液進(jìn)樣10 μL，測定峰面積，每個質(zhì)量濃度進(jìn)樣3次，取平均值。以進(jìn)樣質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo) (X)、峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得二氫楊梅素的回歸方程為Y=2832.7X－101.24(r2=0.9960)，線性范圍為0.5～10.0 μg，表明在此范圍內(nèi)二氫楊梅素線性關(guān)系良好。

1.2.5 精密度試驗 供試品溶液進(jìn)樣10 μL，重復(fù)進(jìn)樣5次，測定二氫楊梅素吸收峰面積，進(jìn)行精密度試驗，RSD值為0.41%～1.95%。

1.2.6 重復(fù)性試驗 稱取同一樣品5份，按照“1.2.3”項制備供試品溶液，進(jìn)行重復(fù)性試驗，RSD為0.07% ～0.24%。

1.2.7 回收率試驗 取已測定的顯齒蛇葡萄樣品9份，按照樣品中二氫楊梅素含有量的0.8、1.0、1.2倍加入對照品，制備供試品溶液，進(jìn)行回收率試驗，加樣回收率為90.01%～96.24%。

方法學(xué)考察結(jié)果表明本研究建立的提取和分析方法能夠滿足二氫楊梅素定量分析的要求。

1.3 樣品測定 供試品溶液進(jìn)樣10 μL，獲得樣品色譜圖 (圖1)，通過回歸方程計算二氫楊梅素的量 (表1)。

2 結(jié)果與分析

2.1 測定結(jié)果分析 檢測結(jié)果顯示各樣品中二氫楊梅素含有量在2.50%～39.50%之間，含有量較低的采樣點為大余縣、衡東縣、恭城縣、平樂縣，基本低于15%，酉陽縣、來鳳縣、黎川縣的較高，多為20%～35%。

圖1 對照品及樣品中二氫楊梅素高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of dihydromyricetin in reference substance and sample

表1 不同采樣點顯齒蛇葡萄中二氫楊梅素的量Tab.1 Contents of dihydromyricetin in Ampelosis grossedentata from different habitats

2.1.1 二氫楊梅素含有量具有地區(qū)差異性 表1顯示，廣東省、廣西省、江西省大余縣、湖南省衡東縣采樣點總體上比其他點低;廣西省恭城縣范圍集中在10%～15%，其鄰縣平樂縣為15% ～20%;江西省黎川縣平均值為34.20%，而大余縣為13.30%，湖南省衡東縣為8.83%，體現(xiàn)出較為明顯的地區(qū)差異性。

2.1.2 同一產(chǎn)地不同植株二氫楊梅素量具有差異性 相對于江西黎川縣各采樣點差異范圍(27.24%～39.50%)，廣西恭城縣 (4.16% ～29.14%)、廣西平樂縣 (2.50% ～19.54%)、江西大余縣 (5.31% ～25.31%)、貴州石阡縣(4.11%～28.23%)產(chǎn)顯齒蛇葡萄中二氫楊梅素量出現(xiàn)較大浮動。

2.2 區(qū)域分布特點分析

2.2.1 不同山脈 結(jié)果顯示，各產(chǎn)地顯齒蛇葡萄葉二氫楊梅素量有較明顯差異，武夷山、武陵山所跨省區(qū)及貴州省境內(nèi)佛頂山產(chǎn)者二氫楊梅素含有量較高，多數(shù)樣品高于20%，而南嶺、羅霄山產(chǎn)者二氫楊梅素量較低，在所采35個樣品中有17個樣品低于15%。

2.2.2 水平分布 長江流域產(chǎn)區(qū)二氫楊梅素量整體高于北回歸線附近的嶺南產(chǎn)區(qū) (圖2)。根據(jù)各采樣點的測定情況，可知江西、湖北、重慶、貴州產(chǎn)顯齒蛇葡萄中二氫楊梅素量處于較高水平，湖南、廣西、廣東樣品的二氫楊梅素量整體處于較低水平。江西等省市均處長江流域，受亞熱帶季風(fēng)氣候影響，四季分明［5］，年積溫高，光、熱、水、土條件優(yōu)越，適合二氫楊梅素的代謝積累;廣西等省采樣點分布在北回歸線附近，高溫多雨為主要氣候特征，適合顯齒蛇葡萄營養(yǎng)生長，但本研究結(jié)果表明對二氫楊梅素積累的促進(jìn)作用不明顯。

圖2 不同產(chǎn)地二氫楊梅素的水平分布圖Fig.2 Horizontal distribution of samples containing different levels of dihydromyricetin

2.2.3 垂直分布 南嶺、羅霄山采樣點的海拔在200 m，所采植株多分布在較背光區(qū)域，導(dǎo)致生長期內(nèi)光熱條件不能滿足二氫楊梅素大量積累的條件;武夷山西麓的黎川縣海拔為400～600 m，同期溫度較高，光照充足，二氫楊梅素含有量整體處于較高水平;武陵山、佛頂山采樣點海拔多為800～1000 m。從各產(chǎn)區(qū)來看，二氫楊梅素含有量與海拔整體上呈正相關(guān) (圖3)。

不同產(chǎn)地植株中二氫楊梅素量在緯度、海拔因素上體現(xiàn)出鮮明的特點，結(jié)果表明緯度高 (集中在長江流域)、海拔高 (大于400 m)的地區(qū)更適合二氫楊梅素積累。不同產(chǎn)地、同一產(chǎn)地不同植株的二氫楊梅素含有量具有差異性，也可能是由各株的遺傳因素造成的。

3 結(jié)語

圖3 不同產(chǎn)地二氫楊梅素的垂直分布規(guī)律Fig.3 Vertical distribution characteristic of samples containing different levels of dihydromyricetin

本研究采樣點所在的各顯齒蛇葡萄主產(chǎn)區(qū)［5-6］，當(dāng)?shù)孛耖g具有悠久的采茶、制茶、用茶歷史［7-9］，以其作為茶飲 (藤茶)原料，同時形成了各自的藤茶文化［10-12］，并且多數(shù)地區(qū)有較為規(guī)范的藤茶加工企業(yè)。本研究的數(shù)據(jù)可為加工企業(yè)收購原料提供參考指標(biāo)，同時可用于判定藤茶產(chǎn)品中二氫楊梅素的含有量情況，為生產(chǎn)、研發(fā)提供依據(jù)，進(jìn)而為合理開發(fā)和利用顯齒蛇葡萄野生資源提供一定依據(jù)。

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