兩個(gè)蘋(píng)果品種（Angold、HL1834）抗褐腐病研究

J.Schovánková,H.Opatová

捷克共和國(guó)化學(xué)工藝研究所食品保鮮與處理系

蘋(píng)果采后損失每年隨天氣條件、果實(shí)狀況和貯藏時(shí)間等因素發(fā)生變化。天氣條件，如冰雹，可使真菌進(jìn)入果實(shí)從而引起腐爛；收獲季節(jié)下雨，可以使某些真菌污染水果。貯藏時(shí)間長(zhǎng)短影響著果實(shí)受感染的時(shí)間，同時(shí)果實(shí)失去其自身抗感染能力，從而產(chǎn)生腐爛。一般來(lái)說(shuō)，高品質(zhì)的水果采用氣調(diào)貯藏，由于氧氣含量低真菌生長(zhǎng)較慢所以腐爛較慢。另一方面，用于加工的質(zhì)量較差的果實(shí)是貯藏于自然條件下，其中大部分果實(shí)受到真菌侵染。有關(guān)專(zhuān)家研究表明，高達(dá)10%的損失可能發(fā)生在貯藏期，因而掌握引起腐爛的原因及其防治方法非常重要。仁果菌核菌、炭疽菌、鏈格孢菌、鐮刀菌、灰霉菌等是導(dǎo)致果實(shí)采后腐爛的主要病菌。

蘋(píng)果褐腐病主要通過(guò)傷口侵入，可在蘋(píng)果和梨成熟期和貯藏期侵染造成腐爛。蘋(píng)果褐腐病分生孢子可以通過(guò)風(fēng)、水、昆蟲(chóng)、鳥(niǎo)和人進(jìn)行傳播。它引起的損傷牢固，形狀不規(guī)則，蔓延迅速，產(chǎn)生大量褐色橢圓形的分生孢子。

眾所周知，植物都具備保護(hù)自己免受真菌侵染的能力，其中一部分是產(chǎn)生酚類(lèi)化合物。它們對(duì)病原感染做出反應(yīng)，促進(jìn)愈合，形成傷口保護(hù)。2001年Rivero等研究發(fā)現(xiàn)，PAL是苯丙烷類(lèi)代謝途徑的主要酶，催化L-苯基丙氨酸轉(zhuǎn)化為反式肉桂酸，肉桂酸是酚類(lèi)物質(zhì)合成過(guò)程中的主要中間物。PAL活性不僅與傷害或暴露于乙烯中有關(guān)，也受其他因素如溫度和真菌感染等影響。

為調(diào)查蘋(píng)果采后腐爛情況，本試驗(yàn)研究了長(zhǎng)期貯存蘋(píng)果對(duì)過(guò)成熟腐爛的反應(yīng)，對(duì)接種腐爛病菌的兩個(gè)品種的表現(xiàn)進(jìn)行了比較，其中Angold是一個(gè)很好的抗性品種，HL 1834是一個(gè)新品種。

1 材料與方法

1.1 試材 兩個(gè)蘋(píng)果品種Angold和HL 1834在10月份果實(shí)商熟期采收，貯藏在2～3°C的環(huán)境下。果實(shí)由捷克共和國(guó)holovousy研究和育種研究所提供，4月份（冷藏貯存6個(gè)月后）接種了褐腐病菌。

1.2 真菌和接種 褐腐病菌由腐爛的蘋(píng)果中提取出來(lái)，8°C在GTK瓊脂上進(jìn)行培養(yǎng)，由捷克共和國(guó)布拉格查爾斯特大學(xué)植物系鑒定，2.9×103真菌孢子利用無(wú)菌針頭接種在每個(gè)水果的兩面。每個(gè)洞深3 mm、寬4 mm，每個(gè)處理重復(fù)3次。接種后，果實(shí)在25°C貯藏4 d，然后貯藏在4℃的環(huán)境中。接種后7 d、14 d、21 d進(jìn)行分析。新鮮果實(shí)（未接種）做為對(duì)照。貯藏期間所有的監(jiān)測(cè)指標(biāo)都發(fā)生了變化。所有的參數(shù)都在長(zhǎng)期存儲(chǔ)中改變，但接種后衰敗很快，因此超過(guò)21 d酚類(lèi)成分變化未統(tǒng)計(jì)，僅在試驗(yàn)初期對(duì)對(duì)照進(jìn)行了評(píng)估。

1.3 酚類(lèi)化合物分析 Escarpa和González 2001年進(jìn)行了酚類(lèi)化合物的提取和定性分析，從隨機(jī)抽取的3個(gè)蘋(píng)果中取蘋(píng)果皮1.5 g，果肉 2.5 g，及整果 2.5 g（果肉和果皮的混合物），利用80%的甲醛與BHT混合物（丁化羥基甲苯）進(jìn)行超聲振蕩2 h。提取物置于-20°C貯藏進(jìn)行分析。

利用分光光度分析法和Folin-Ciocalteu酚試劑法結(jié)合測(cè)定總酚含量，將提取物、0.5 mL Folin-Ciocalteu酚試劑、10 mL 1mol/L碳酸鈉混合，1 h后計(jì)算 750 nm的吸光率。沒(méi)食子酸作標(biāo)樣，每次處理設(shè)3次重復(fù)。利用高效液相色譜結(jié)合紫外檢測(cè)來(lái)測(cè)定酚類(lèi)物質(zhì)。色譜柱：Zorbax C8(150 mm× 4 mm,5 μm)。 流動(dòng)相A：0.01M 磷酸，流動(dòng)相 B：0.01 mol/L乙腈-磷酸，洗脫曲線(xiàn)程序：5%～20%B進(jìn)行0～15 min，20%～40%B 進(jìn)行 15～20 min，40%～80%B 進(jìn)行 20～22 min，80%B 進(jìn)行 22～28 min,流速為 1 mL/min，每個(gè)處理3次重復(fù)。

1.4 苯丙氨酸解氨酶 （PAL）活性 2005年Morelló等利用改良的方法測(cè)定了PAL活性。25 g樣品 （3個(gè)蘋(píng)果果皮和果肉的混合物）與50 ml濃度為 0.1mol/L磷酸緩沖液 （pH值6.5）和1.875g聚乙烯吡咯烷酮混勻。0.4ml的上清液，4.1 ml的硼酸鈉緩沖液（pH 8.5）和1 ml L-苯丙氨酸（10 mg/ml）混勻。在 35 °C 培養(yǎng)1 h后測(cè)定吸光率，酶的活性利用每小時(shí)每克果肉釋放的肉桂酸含量（μmol）表達(dá)。每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)。

1.5 數(shù)據(jù)分析 采用STATISTICA 9統(tǒng)計(jì)軟件 （捷克共和國(guó)布拉格市StatSoft CR有限公司）進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)變化利用線(xiàn)性回歸和方差分析進(jìn)行比較（P＜0.05），Tukey 0.05 水平和Spearman相關(guān)系數(shù)測(cè)定參數(shù)之間的差異。Dunnett檢測(cè)對(duì)照和待測(cè)樣品之間的差異。

2 結(jié)果與分析

Angold和HL 1834的果皮厚度分別為69.6 μm 、59.6 μm 。 如果果皮厚度影響真菌進(jìn)入果皮的透性，那么這個(gè)參數(shù)將會(huì)很重要。2007年Blazek等研究發(fā)現(xiàn)Angold抗細(xì)菌感染，果實(shí)厚度可能是原因之一。在我們以前未公開(kāi)的研究中測(cè)定了幾個(gè)蘋(píng)果品種的酚含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Angold酚類(lèi)物質(zhì)含量最高，HL 1834含量最低。試驗(yàn)結(jié)果也表明多酚氧化酶（PPO）和過(guò)氧化氫酶活性之間存在著顯著差異。

最初，兩個(gè)品種接種腐爛病菌后都有類(lèi)似的腐爛現(xiàn)象，接種7 d后的腐爛區(qū)域直徑為3.5～4.5 cm。最后HL-1834腐爛情況很?chē)?yán)重，21 d后健康組織幾乎不能分析。

2.1 總酚含量 在新鮮的果肉和果皮總酚含量分別為：Angold果肉1608±15 mg/kg，果皮5483±36 mg/kg，HL 1834 果肉 1273±21 mg/kg，果皮3582±28 mg/kg。兩個(gè)品種果皮和果肉中總酚含量存在顯著的差異 (P＜0.05)，并且2個(gè)品種果肉中總酚含量都比果皮中的低。 1998年Escarpa、González， 及2003年Tsao等試驗(yàn)得出的結(jié)果與此類(lèi)似。

接種后各品種表現(xiàn)出不同的反應(yīng)，與對(duì)照相比，Angold腐爛組織和正常組織周?chē)目偡雍拷档停≒＜0.05）。而 HL 1834開(kāi)始合成或釋放新的酚類(lèi)物質(zhì)。與對(duì)照相比，腐爛組織果皮和果肉中的酚類(lèi)物質(zhì)增加，而接種7 d后正常組織果肉酚類(lèi)物質(zhì)增加（P＜0.05）。兩個(gè)品種之間的顯著差異可能與Angold本身酚類(lèi)物質(zhì)比較高有關(guān)，這也可能是苯丙氨酸解氨酶和苯丙烷代謝在衰敗中未激活的原因。在幾乎所有的情況下，腐爛組織周?chē)宇?lèi)物質(zhì)的含量明顯比正常組織中的高。Lattanzio等在2001年也有過(guò)類(lèi)似的報(bào)道。21 d后HL 1834沒(méi)有完好的果肉可供分析，因?yàn)楣は碌慕M織開(kāi)始腐爛，試驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)接種腐爛部位周?chē)目偡雍恐饾u降低。

2.2 PAL活性 采用整個(gè)蘋(píng)果(果肉和果皮)進(jìn)行PAL活性分析。結(jié)果表明，兩個(gè)品種的PAL 活性明顯不同（P＜0.05），Angold 新鮮果實(shí)PAL活性為 1.07 μmol肉桂酸/g/h ，HL 1834的為 0.75 μmol肉桂酸/g/h，PAL活性與總酚含量及所選的單個(gè)酚類(lèi)物質(zhì)濃度有關(guān)。Angold隨著總酚含量的減少，PAL活性降低（P＜0.05），而HL 1834的酶活性最初增加，腐爛位置附近活性最強(qiáng)，但是7 d后活性降低。正常組織的PAL活性一直在緩慢增加，推斷可能由于腐爛的影響和自身防御系統(tǒng)的誘導(dǎo)產(chǎn)生了這種現(xiàn)象。腐爛組織的總酚含量和PAL活性一直在降低（P＜0.05）。

結(jié)果顯示PAL活性和總酚含量相關(guān)性密切。在接種的部分果實(shí)中，酶活性和總酚含量之間的關(guān)系r=0.71-0.99。

2.3 酚類(lèi)化合物濃度 綠原酸、兒茶素、表兒茶素、咖啡酸和根皮苷是蘋(píng)果中重要的酚類(lèi)物質(zhì)，其中很多用于抗真菌方面的研究，許多專(zhuān)家已經(jīng)確認(rèn)了他們?cè)谔O(píng)果抗性機(jī)理中發(fā)揮的重要作用。表1表明大量酚類(lèi)化合物存在于未接種的果肉和果皮中。在測(cè)定的酚類(lèi)物質(zhì)中，綠原酸是Angold品種中最重要的化合物，然而表兒茶酸、綠原酸和兒茶素是HL 1834中典型的酚類(lèi)物質(zhì)，除了HL 1834中的綠原酸外，果皮中的酚類(lèi)物質(zhì)含量比果肉中的高。兩個(gè)品種酚類(lèi)物質(zhì)不同，可能是苯基丙烷代謝酶不同引起。

表1 新鮮樣品中的酚類(lèi)物質(zhì)含量 單位：mg/kg

接種后觀(guān)察到不同的酚類(lèi)化合物濃度的增加。Angold含有高水平的酚類(lèi)物質(zhì)，接種7d后只產(chǎn)生了少量的酚類(lèi)化合物，如咖啡酸，兒茶素、表兒茶素。如果合成其他物質(zhì)，可能也立刻改變?yōu)槠渌苌?。HL-1834中的綠原酸、兒茶素、表兒茶素主要是合成的。

品種間的差異可能是由于苯丙氨酸代謝途徑中不同酶的活性引起。2005年Morelló等和 Jones 1984年所做的試驗(yàn)都表明，1-苯丙氨酸解氨酶是苯丙氨酸化合物合成過(guò)程中的第一步。

試驗(yàn)結(jié)果也表明，兩個(gè)品種健康部位的PAL和綠原酸之間有很好的相關(guān)性 （r=0.98-0.99）。在腐爛部位周?chē)慕M織中，PAL和兒茶素的關(guān)系r=0.92，PAL和表兒茶素PAL和r=0.80，僅在HL 1834中發(fā)現(xiàn)PAL和咖啡酸的關(guān)系為r=0.77。

我們可以得出這樣的結(jié)論：PAL活性不是特定酚類(lèi)化合物生產(chǎn)與否的信號(hào)。苯丙烷代謝是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，可能許多化學(xué)反應(yīng)同時(shí)發(fā)生，產(chǎn)生的許多化合物立即轉(zhuǎn)換成其他物質(zhì)。酚類(lèi)化合物也以結(jié)合物的形式存在，如糖苷形式。它們可能會(huì)在病毒侵染、昆蟲(chóng)進(jìn)食、產(chǎn)卵時(shí)通過(guò)酶或其他水解的形式釋放。因此，很難找到PAL活性和單一酚類(lèi)物質(zhì)濃度之間的直接關(guān)系。

3 結(jié)論

化學(xué)物質(zhì)，尤其是參與苯丙烷代謝的酚類(lèi)化合物含量和酶，都影響受病毒感染的水果的生化反應(yīng)。試驗(yàn)是在商熟階段（不是過(guò)熟）進(jìn)行，目的是檢測(cè)長(zhǎng)期儲(chǔ)存水果生化反應(yīng)。未成熟果實(shí)的生化反應(yīng)可能不同。我們對(duì)感染蘋(píng)果的初步研究表明，一些品種（如Angold）收獲后能夠抵抗病原體的侵入，但貯存4個(gè)月后抗真菌能力喪失。但也有些學(xué)者推斷越來(lái)越多的蘋(píng)果感染褐腐病可能與果實(shí)的成熟期及果實(shí)糖含量有關(guān)。

本研究是不同蘋(píng)果品種接種褐腐病后生化反應(yīng)的一個(gè)很好的例子，基于試驗(yàn)結(jié)論，我們推斷HL 1834抗真菌能力弱，不大適合進(jìn)行有機(jī)生產(chǎn)。然而，盡管與Angold相比，該品種酚類(lèi)物質(zhì)含量較低，酚類(lèi)物質(zhì)不同，并且PAL活性較低，但是它的防御系統(tǒng)仍在運(yùn)行，病灶的直徑與Angold接種褐腐病菌7 d后的類(lèi)似，然而，其防御系統(tǒng)不足以限制病原菌的進(jìn)一步發(fā)展。必須注意的是，試驗(yàn)中蘋(píng)果是被故意破壞并被接種真菌。等認(rèn)為，如果沒(méi)有損傷，果實(shí)腐爛不可能那么容易出現(xiàn)，并擴(kuò)展的那么快。同時(shí)，蘋(píng)果褐腐病菌和炭疽菌相比，是一個(gè)侵入性強(qiáng)的真菌。

Jones等認(rèn)為果肉和果皮中單一酚類(lèi)物質(zhì)的不同可能是因?yàn)橄鄳?yīng)酶位置的不同引起。細(xì)胞和亞細(xì)胞中相關(guān)酶的位置是決定次生代謝產(chǎn)物和最終產(chǎn)物的重要因素。確定除了綠原酸外，未發(fā)現(xiàn)PAL活性與特定酚類(lèi)物質(zhì)有關(guān)。在一些文章中認(rèn)為PAL活性與酚類(lèi)化合物之間存在著相關(guān)性，并且在土豆和轉(zhuǎn)基因煙草中曾報(bào)道PAL活性與綠原酸有相關(guān)性。我們可以得出這樣的結(jié)論：苯丙氨酸解氨酶的活性或其代謝受酚類(lèi)化合物含量的影響，從Angold接種真菌后的反應(yīng)也能看出?？赡苁怯捎谶@個(gè)品種的酚類(lèi)化合物含量高，病原攻擊后PAL未被激活，多酚氧化酶使酚類(lèi)氧化成醌類(lèi)物質(zhì)，我們?cè)谑軗p傷但未接種真菌的蘋(píng)果中也發(fā)現(xiàn)類(lèi)似反應(yīng)，PAL活性較低，而高活性的PPO參與木質(zhì)化過(guò)程。