鹽酸阿扎司瓊注射液局部安全性實驗研究

樊 華，康 強，孫 丹，李常國，王秀英，樊 榮（.遼寧省藥品檢驗檢測院，沈陽 003；.中國醫(yī)科大學(xué)，沈陽 000）

鹽酸阿扎司瓊是一種高效、高選擇性的5－HT3受體拮抗劑，系由日本Mitsubishi Pharma公司研發(fā)的止吐藥，1994年首次在日本上市，2001年國產(chǎn)阿扎司瓊被批準在國內(nèi)上市，其注射液臨床用于細胞毒類藥物化療引起的嘔吐［1－2］。為了保證注射劑的質(zhì)量、確保用藥安全，除進行必要的理化研究之外，還需要從藥理毒理學(xué)研究的角度對制劑進行評價。本研究按照國家食品藥品監(jiān)督管理局注射劑研制指導(dǎo)原則有關(guān)安全性實驗項目要求進行了血管刺激性、肌肉刺激性、全身主動過敏實驗、溶血與凝聚實驗的安全性評價，為臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 ES1OK－1電子天平，沈陽龍騰電子有限公司；OLYMPUS－BX41電子顯微鏡，日本；全自動脫水機（TP1020），德國萊卡儀器公司；切片機（RM2105），德國萊卡儀器公司；80－1型電動離心沉淀機，上海手術(shù)器械廠。

1.2 試藥 鹽酸阿扎司瓊注射液（性狀：本品為無色澄明液體，規(guī)格：2mL∶10mg，批號091201，寧波市天衡制藥有限公司）；氯化鈉注射液（規(guī)格250mL∶2.25g，批號9 08110121，大連泰華藥業(yè)有限公司）；甲醛（規(guī)格：500mL，批號20080922，SCRC國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；全身主動過敏實驗陽性對照液為自制2%新鮮雞蛋清。

1.3 動物 家兔，日本大耳白兔，體質(zhì)量2.5～2.8kg，數(shù)量9只，來源：沈陽藥科大學(xué)實驗動物中心，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（遼）2009－0002，實驗動物使用許可證號：SYXK（遼）2008－0008，動物飼養(yǎng)條件：自由飲水（城市飲用水），光照為晝夜明暗交替12h／12h；控制動物室環(huán)境：溫度22.4～24.1℃，濕度50%～78%。

豚鼠，體質(zhì)量306～365g，雌雄兼用，數(shù)量24只，來源：沈陽藥科大學(xué)實驗動物中心，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（遼）2009－0002，實驗動物使用許可證號：SYXK（遼）2008－0008。動物飼養(yǎng)條件：自由飲水（城市飲用水），光照為晝夜明暗交替12h／12h；控制動物室環(huán)境：溫度21.7～25.3℃，濕度49%～72%。每日更換飲水和飼料1次，并加喂新鮮蔬菜以補充體內(nèi)的維生素C。

2 方法與結(jié)果

2.1 血管刺激性實驗 檢疫合格的家兔4只，采用兔同體左右側(cè)自身對比法，左側(cè)耳緣靜脈注射0.25mg·mL－1鹽酸阿扎司瓊注射液，右側(cè)注射等體積的氯化鈉注射液，給藥體積為2mL·kg－1，緩慢靜脈注射，1mL·min－1，每日1次，連續(xù)5d。給藥前、給藥期間、末次給藥后48，72和96h肉眼觀察并記錄血管及周圍組織有無異常改變；末次給藥96h后處死動物，取兩側(cè)耳緣靜脈血管及周圍組織，以100mL·L－1甲醛固定，切片，HE染色，光鏡下（10×10）觀察血管內(nèi)皮有無受損、破裂及周圍組織有無水腫、出血及炎性細胞浸潤等病理變化［3－6］，并按表1判斷血管刺激性反應(yīng)程度。根據(jù)肉眼觀察和組織病理學(xué)檢查的結(jié)果綜合評價，鹽酸阿扎司瓊注射液（0.25mg·mL－1），按2mL·kg－1靜脈緩慢推注兔耳緣靜脈內(nèi)，每日1次，連續(xù)5d，對兔耳靜脈血管無刺激性。結(jié)果評分見表1和表2。

表1 血管刺激性肉眼觀察評分標(biāo)準Tab.1 Scoring standard of stimulation of vascular with the naked eye

表2 鹽酸阿扎司瓊注射液血管刺激性實驗結(jié)果Tab.2 Result of Azastron Hydrochloride Injections on vascular irritation test （n＝4）

2.2 肌肉刺激性實驗 取健康家兔，雌雄兼用，動物入室后，對動物的外觀、體質(zhì)量等進行檢疫，檢疫期為3d。取檢疫合格后動物4只，采用兔同體左右側(cè)自身對照法，左側(cè)股四頭肌注射鹽酸阿扎司瓊注射液0.25mg·mL－1，右側(cè)股四頭肌注射同體積的氯化鈉注射液，每側(cè)給藥體積為1mL，給藥1次，48h后處死動物，按表3評分標(biāo)準肉眼觀察肌肉注射部位有無充血、水腫、變性和壞死等刺激現(xiàn)象，并根據(jù)刺激反應(yīng)的程度進行評分。觀察結(jié)束后取給藥部位，以100mL·L－1甲醛固定，切片，HE染色，顯微鏡下（10×10）觀察肌間有無出血、炎性細胞浸潤等病理變化［3－6］。根據(jù)肉眼觀察的評分和組織病理學(xué)檢查結(jié)果對藥物肌肉刺激性程度進行綜合評價，評分標(biāo)準見表3。鹽酸阿扎司瓊注射液0.25mg·mL－1肉眼觀察給藥組肌肉未見明顯刺激性；組織病理學(xué)檢查顯示，給藥組肌纖維橫紋清晰，肌間無出血、無炎性細胞浸潤等病理變化，與對照組相比未見明顯差別。鹽酸阿扎司瓊注射液（0.25mg·mL－1）對兔股四頭肌未見明顯刺激性。

表3 肌肉刺激性肉眼觀察評分標(biāo)準Tab.3 Scoring standard of stimulation of muscle with the naked eye

2.3 全身主動過敏實驗 取上述健康豚鼠，對其外觀、體質(zhì)量等進行檢疫，檢疫期為3d，檢疫合格后，按體質(zhì)量隨機分為4組，每組6只，分別為鹽酸阿扎司瓊注射液低劑量組、高劑量組、陽性對照組及陰性對照組。低劑量組腹腔注射0.43mg·mL－1鹽酸阿扎司瓊注射液，高劑量組腹腔注射2.15mg·mL－1鹽酸阿扎司瓊注射液，陽性對照組注射0.2mL·L－1新鮮雞蛋清，陰性對照組注射9g·L－1氯化鈉注射液，給藥體積為每只0.5mL，隔日致敏1次，連續(xù)5次，致敏期間及觀察期間每日觀察并記錄各組動物的反應(yīng)癥狀。末次致敏后第14天各組分別靜脈注射上述藥液1mL／只，按表4觀察記錄給藥后30min內(nèi)動物變態(tài)反應(yīng)癥狀、癥狀的出現(xiàn)時間及消失時間。根據(jù)表4判斷變態(tài)反應(yīng)的發(fā)生程度，計算變態(tài)反應(yīng)發(fā)生率。結(jié)果見表5。根據(jù)變態(tài)反應(yīng)發(fā)生率和發(fā)生程度對藥物進行綜合判斷［3－6］。結(jié)果顯示，各組激發(fā)后30min內(nèi)陰性對照組未見變態(tài)反應(yīng)，陽性對照組在靜脈注射后即刻全部動物均出現(xiàn)躁動、呼吸急促、排尿、呼吸困難、跳躍直至死亡等過敏癥狀，4min內(nèi)6只動物全部死亡，屬極強陽性變態(tài)反應(yīng)，鹽酸阿扎司瓊注射液高劑量組和低劑量組動物30min內(nèi)均未見變態(tài)反應(yīng)。

表4 變態(tài)反應(yīng)癥狀評價Tab.4 The valuation of anaphylaxis

表5 鹽酸阿扎司瓊注射液過敏實驗結(jié)果Tab.5 Result of Azastron Hydrochloride Injections on active systemic anaphylaxis （n＝6）

2.4 溶血性實驗 取檢疫合格的健康家兔1只，心臟取血20mL，玻璃珠振搖除去纖維蛋白原，使成脫纖血。用9g·L－1氯化鈉注射液洗滌、離心（1 000r·min－1，15min）3次至上清液不顯紅色，沉淀的紅細胞按體積比用9g·L－1氯化鈉注射液配成2%紅細胞混懸液。取潔凈試管8支，編號，1～6號管為鹽酸阿扎司瓊注射液管，7號管為陰性對照管，8號管為陽性對照管。按表7所示依次加入不同體積的受試物溶液、氯化鈉注射液、蒸餾水及2%紅細胞懸液，混勻后，立即置于37±0.5℃的恒溫箱中進行溫育。觀察各管在0.25，0.5，0.75，1，2和3h時是否有溶血和紅細胞凝聚現(xiàn)象，并判斷鹽酸阿扎司瓊注射液臨床使用質(zhì)量濃度是否產(chǎn)生溶血及紅細胞凝聚作用。實驗結(jié)果見表6。

表6 鹽酸阿扎司瓊注射液溶血實驗Tab.6 Hemolysis test of Azastron Hydrochloride Injections

結(jié)果表明，3h內(nèi)陰性對照管上層溶液呈無色透明，紅細胞全部下沉，未見溶血現(xiàn)象，陽性對照管溶液呈澄明紅色，管底無細胞殘留，完全溶血。鹽酸阿扎司瓊注射液0.25mg·mL－1各管3h內(nèi)紅細胞全部下沉，未見紅棕色絮狀沉淀，上層溶液呈無色透明，與供試品陰性對照管比較未見明顯差別。各管3h均未見有凝聚現(xiàn)象。

3 討論

鹽酸阿扎司瓊注射液是主要用于細胞毒類藥物化療引起的嘔吐的一種止吐藥，用前需用生理鹽水稀釋成4mg·mL－1，于化療前30min緩慢靜脈注射。本研究通過對鹽酸阿扎司瓊注射液進行安全性評價，為其臨床用藥安全提供實驗依據(jù)。在本實驗條件下，鹽酸阿扎司瓊注射液對家兔耳緣靜脈血管壁無刺激性、對兔股四頭肌無刺激性、對兔紅細胞無體外溶血和凝集作用、對豚鼠無全身主動變態(tài)反應(yīng)。由此可見，該藥在本實驗條件下符合注射液的安全性要求，值得臨床上進一步推廣應(yīng)用。

［1］袁哲東，俞雄，王強，等.鹽酸阿扎司瓊的合成［J］.中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，2006，37（1）：1－3.

［2］王德旺，王永慶，馬坤芳，等.鹽酸阿扎司瓊注射液與輸液配伍的穩(wěn)定性研究［J］.中國藥業(yè)，2010，19（24）：20－21.

［3］《中藥、天然藥物刺激性和溶血性研究的技術(shù)指導(dǎo)原則》課題研究組.中藥、天然藥物刺激性和溶血性研究的技術(shù)指導(dǎo)原則 （［Z］GPT4－1）［S］.北京：中國食品藥品監(jiān)督管理局，2005：22－24.

［4］吳虓飛，金翠英，田悅，等.參丹芎注射液的安全性實驗研究［J］.藥物評價研究，2012，35（2）：103－105.

［5］田日升，趙進，王宇鵬.葛根素注射液的血管刺激性、溶血及過敏性實驗研究［J］.西北藥學(xué)雜志，2009，24（4）278－279.

［6］張芳艷，趙欣欣，辛志偉.冬青注射液血管刺激性、溶血性及過敏性試驗研究［J］.中國實用醫(yī)藥，2012，7（23）64－65.