2-脫氧-D-葡萄糖對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的作用

程 靜， 張冠華， 易成剛， 余 州， 宋雅娟， 楊 力

2-脫氧-D-葡萄糖對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的作用

程 靜， 張冠華， 易成剛， 余 州， 宋雅娟， 楊 力

目的觀察2-脫氧-D-葡萄糖對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、管腔形成及細(xì)胞凋亡的影響，試圖尋找治療血管瘤的新藥。方法用四甲基偶氮唑鹽比色法、倒置顯微鏡下形態(tài)學(xué)觀察、體外劃痕實(shí)驗(yàn)的方法，觀察2-脫氧-D-葡萄糖對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)增殖、遷移的作用；用成管法，檢測(cè)2-DG對(duì)血管形成的影響；用流式細(xì)胞儀檢測(cè)2-DG對(duì)血管內(nèi)皮的凋亡影響。結(jié)果2-DG作用于人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞后，對(duì)其增殖，遷移和成管能力有明顯抑制作用，大大地增加細(xì)胞的凋亡率，且有顯著劑量和時(shí)間依賴性。結(jié)論2-DG對(duì)HUVEC增殖、遷移和成管有顯著的抑制作用,且能促使細(xì)胞凋亡。

2-脫氧-D-葡萄糖； 臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞； 血管瘤

血管瘤是嬰幼兒最常見(jiàn)的先天性良性腫瘤，1歲以下發(fā)病率約為10%，早產(chǎn)兒或低體質(zhì)量新生兒發(fā)病率可高達(dá)22%～30%[1]。血管瘤可發(fā)生于全身各處，約60%發(fā)生于頭頸部。嚴(yán)重影響美觀，甚至影響生理功能，威脅生命[2-3]。血管瘤的臨床治療包括激光、普萘洛爾等多種方法[4-5]。2-脫氧-D-葡萄糖(2-deoxy-glucose, 2-DG)是一種葡萄糖類似物，除了c-2端的-OH被-H取代外，其余結(jié)構(gòu)與葡萄糖一致，它可以抑制內(nèi)皮細(xì)胞的糖酵解途徑和抑制其N(xiāo)-連接糖基化作用(R Datema, 1979年)[6]，從而影響腫瘤生長(zhǎng)的多個(gè)環(huán)節(jié)。血管瘤是以血管內(nèi)皮細(xì)胞異常增殖為主要病理特征的良性血管病變[7]，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)和血管內(nèi)皮細(xì)胞有相似的特性。我們利用HUVECs進(jìn)行初步研究，觀察2-DG對(duì)HUVECs增殖、遷移、成管及凋亡的作用。

1 對(duì)象與方法

1.1 主要材料 2-DG(美國(guó)SIGMA公司)；人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株(北京清源浩生物公司)；ECM培養(yǎng)基(美國(guó)SCIENCELL公司)；胎牛血清、胰蛋白酶、二甲基亞砜(美國(guó)GIBCO公司)；DMSO、MTT(美國(guó)SIGMA公司)；Matrigel、流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)；Annexin V-FITC凋亡檢測(cè)試劑盒(北京寶賽生物技術(shù)有限公司)；倒置顯微鏡(日本NIKON公司)。

1.2 分組 本實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組和2-DG試驗(yàn)組，試驗(yàn)組按照2-DG的濃度分為0.06、0.6、6、9 mM 2-DG處理組。

1.3 HUVECs的培養(yǎng)與傳代 HUVEC購(gòu)自北京清源浩生物公司，接種于T-75培養(yǎng)瓶(poly-l-lysine包被)內(nèi)，加入ECM培養(yǎng)基，置于37 ℃，5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)至細(xì)胞密度為90%時(shí)，用Trypsin-EDTA消化成細(xì)胞懸液，再傳代于T-75培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，繼續(xù)培養(yǎng)。將培養(yǎng)至3～6代的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.4 四甲基偶氮唑鹽比色法檢測(cè)2-DG對(duì)HUVECs細(xì)胞增殖活性的影響 將HUVECs經(jīng)Trypsin-EDTA消化后制成細(xì)胞懸液，記數(shù)，按每孔104個(gè)細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，共接種9塊板。常規(guī)培養(yǎng)24 h，待其貼壁后，向?qū)φ战M和實(shí)驗(yàn)組分別加入0、0.06、0.6、6、9 mM 2-DG，繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)，分別于第1～9天各取出一塊板，每孔加入20 μl MTT，再放入孵箱中繼續(xù)孵育4 h時(shí)，取出后吸掉孔內(nèi)上清液，加入150 μl DMSO，震蕩10 min，在酶聯(lián)免疫儀上選擇490 nm波長(zhǎng)測(cè)各孔的吸光度值(OD值)。

1.5 倒置顯微鏡細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察2-DG對(duì)HUVECs細(xì)胞生長(zhǎng)和形態(tài)的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的HUVECs，經(jīng)Trypsin-EDTA消化后接種于用六孔板(poly-l-lysine包被)中，常規(guī)培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞密度為90%，向?qū)φ战M和實(shí)驗(yàn)組分別加入0、0.06、0.6、6、9 mM 2-DG，放入孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)，分別于0、24、48 h用OLYMPUS倒置顯微鏡拍照，觀察細(xì)胞數(shù)量和形態(tài)變化。

1.6 體外劃痕法檢測(cè)2-DG對(duì)HUVECs遷移能力的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的HUVECs，消化并接種到6孔板(poly-l-lysine包被)中，常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞密度為90%時(shí)，向每孔內(nèi)加入20 μl絲裂霉素C，繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)2 h，取出后用滅菌的1 ml槍頭在每孔中心劃十字線，吸掉培養(yǎng)基，用PBS液洗兩遍，向?qū)φ战M和實(shí)驗(yàn)組分別加入0、0.06、0.6、6、9 mM 2-DG，放入孵箱中培養(yǎng)，于0、12 h用OLYMPUS倒置顯微鏡拍照，統(tǒng)計(jì)。

1.7 Matrigel成管法檢測(cè)檢測(cè)2-DG對(duì)HUVECs成管能力的影響 用槍頭(預(yù)冷)吸取50 μl Matrigel均勻鋪到96孔板(預(yù)冷)中，放入培養(yǎng)箱，放置30 min，使Matrigel凝固后取出。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的HUVECs，消化后制成1×104/ml的細(xì)胞懸液，按每孔50 μl將其加入96孔板，向?qū)φ战M和實(shí)驗(yàn)組分別加入0、0.06、0.6、6、9 mM 2-DG，繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)，在0、12 h取出，用OLYMPUS倒置顯微鏡拍照，統(tǒng)計(jì)。

1.8 流式細(xì)胞儀檢測(cè)2-DG對(duì)HUVECs凋亡影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的HUVECs，消化并接種于6孔板中，常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞密度為90%時(shí)，向?qū)φ战M和實(shí)驗(yàn)組分別加入0、0.06、0.6、6、9 mM 2-DG，繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)24 h，取出并消化，收集到15 ml離心管中離心(800 r/min，5 min)，棄上清，用預(yù)冷的PBS洗2遍后再離心，取出用Bing Buffer(結(jié)合液)重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×104/ml，置入流式專用管中，分別加入5 μl FITC Annexin V和5 μl PI進(jìn)行處理，輕輕混勻細(xì)胞，室溫避光孵育15 min，取出，每管加入400 μl Bing Buffer，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)并分析。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件處理分析，組間比較t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MTT比色法檢測(cè)2-DG對(duì)HUVECs活力的影響 用不同濃度2-DG處理HUVECs 72 h后取出，測(cè)得其在490 nm波長(zhǎng)處的OD值，與對(duì)照組相比，HUVECs的細(xì)胞活力隨著2-DG劑量的增加逐漸減小，0.06 mM 2-DG處理組只能小幅度抑制HUVECs的活力，而0.6 mM 2-DG處理組的細(xì)胞活力為49.6%，有明顯的抑制作用；6、9 mM 2-DG處理組的抑制程度更加明顯，均在60%以上。

2.2 倒置顯微鏡細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察2-DG對(duì)HUVECs細(xì)胞數(shù)量和形態(tài)的影響 用不同濃度2-DG處理HUVECs，分別于0、24、48 h用OLYMPUS倒置顯微鏡拍照，觀察細(xì)胞的數(shù)量和形態(tài)變化。對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)良好，呈梭型，邊界清楚，排列緊密，貼壁牢固，胞漿豐富，內(nèi)含小顆粒，呈鋪路石樣生長(zhǎng)，隨著時(shí)間的變化，細(xì)胞形態(tài)和數(shù)量均無(wú)明顯變化。實(shí)驗(yàn)組中，0.6 mM 2-DG作用HUVECs 24 h，細(xì)胞數(shù)量略少，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象，體積變小，細(xì)胞質(zhì)收縮，間隙增大，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生少許變化，且少量細(xì)胞脫落和損傷；作用48 h，細(xì)胞數(shù)量明顯減少，形態(tài)變化更加明顯，且大量細(xì)胞受損脫落。隨著2-DG濃度的增加或隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞數(shù)量減少且形態(tài)發(fā)生更加明顯的變化。

2.3 2-DG抑制HUVECs的遷移能力 細(xì)胞遷移是血管瘤生長(zhǎng)中內(nèi)皮細(xì)胞血管形成重要的環(huán)節(jié)。12 h后對(duì)照組細(xì)胞已遷移至劃痕區(qū)域(虛線內(nèi))，幾乎爬滿整個(gè)劃痕區(qū)域(圖1)，而9 mM 2-DG處理組僅有極少量細(xì)胞發(fā)生遷移(圖2)。0.06 mM 2-DG處理組細(xì)胞遷移抑制率為26.4%，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，隨著2-DG劑量增大，抑制率隨之增大， 6 mM 2-DG處理組細(xì)胞遷移抑制率大大增加，已超過(guò)50%(圖3)。

2.4 2-DG抑制HUVECs的成管能力 HUVECs在Matrigel中能自發(fā)形成毛細(xì)血管狀結(jié)構(gòu)。對(duì)照組中HUVECs經(jīng)過(guò)12 h可自發(fā)形成連接在一起的微管，而9 mM 2-DG處理組形成微管的能力較差，統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明該濃度能顯著抑制HUVECs的成管能力，低劑量2-DG處理組也能不同程度的抑制HUVECs微管形成。

2.5 流式細(xì)胞儀法測(cè)2-DG對(duì)HUVECs的凋亡影響影響 誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡是抑制血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞增殖的重要環(huán)節(jié)，本實(shí)驗(yàn)用Annexin V 和PI 雙染色法通過(guò)流式細(xì)胞儀來(lái)分析2-DG對(duì)HUVECs的凋亡影響，如圖4所示， 2-DG能誘導(dǎo)HUVECs的細(xì)胞凋亡，且隨著2-DG劑量的增大HUVECs凋亡細(xì)胞的數(shù)量也隨之增多，對(duì)照組細(xì)胞凋亡率為10.63%,0.6 mM 2-DG處理組比對(duì)照組上升4.77%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，6 mM和9 mM 2-DG處理組誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡更加明顯，凋亡率為21.77%和25.07%，比對(duì)照組上升了1倍多。

3 討論

目前，血管瘤的病因有溶性細(xì)胞因子學(xué)說(shuō)、基因突變學(xué)說(shuō)、細(xì)胞凋亡學(xué)說(shuō)、血管內(nèi)皮祖細(xì)胞學(xué)說(shuō)和缺氧學(xué)說(shuō)等幾種假說(shuō)[8]，但發(fā)病機(jī)制尚未確切，臨床上多為經(jīng)驗(yàn)性用藥和對(duì)癥性治療，并無(wú)特效的根治方法。2-DG可以抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和分化，且已經(jīng)進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)階段，在腫瘤細(xì)胞中2-DG 主要通過(guò)以下兩個(gè)方面來(lái)發(fā)揮作用：一方面，在缺氧的條件下，2-DG主要通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性的抑制磷酸葡萄糖異構(gòu)酶來(lái)抑制糖酵解途徑，阻斷了細(xì)胞獲得ATP的主要來(lái)源，從而阻止細(xì)胞的快速增殖、遷移和分化；另一方面，無(wú)論是在有氧還是無(wú)氧的條件下，2-DG可通過(guò)抑制細(xì)胞的N-連接糖基化作用來(lái)抑制細(xì)胞的增殖、遷移和分化。2-DG聯(lián)合化療的抗腫瘤作用已被體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)(RI Aft, 2002年)[9-11]， 2004年，有學(xué)者通過(guò)臨床試驗(yàn)證實(shí)2-DG與多烯紫杉醇聯(lián)合治療實(shí)體瘤細(xì)胞的效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于單獨(dú)應(yīng)用多烯紫杉醇[12]。在小鼠異種移植瘤模型和臨床試驗(yàn)中，2-DG與放療結(jié)合的療效明顯高于放療單獨(dú)作用的效果[13]，口服2-DG的安全性和可行性也已經(jīng)在腫瘤病人的早期臨床治療中得到驗(yàn)證[14]。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)2-DG體外細(xì)胞試驗(yàn)的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)2-DG能顯著抑制HUVECs的增殖、遷移和成管，使細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變，同時(shí)能誘導(dǎo)HUVECs的凋亡。在2-DG作用12 h時(shí)，可觀察到2-DG有明顯的抑制HUVECs成管和遷移的作用，在6 mM 2-DG作用下， HUVECs基本上不能形成管腔結(jié)構(gòu)，當(dāng)增加藥物濃度時(shí)，鏡下僅能觀察到些許細(xì)胞團(tuán)塊；細(xì)胞處理12 h后，在鏡下觀察細(xì)胞的遷移情況時(shí)發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組細(xì)胞基本爬滿整個(gè)視野，而經(jīng)6 mM 2-DG處理的實(shí)驗(yàn)組，細(xì)胞遷移率不超過(guò)50%。在2-DG作用24 h時(shí)，通過(guò)流式細(xì)胞試驗(yàn)檢測(cè)凋亡蛋白，說(shuō)明2-DG可以誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡，且隨著劑量的增加，凋亡細(xì)胞所占比例也隨之增大。通過(guò)細(xì)胞形態(tài)試驗(yàn)和MTT比色試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)隨著時(shí)間的推移，活細(xì)胞的數(shù)量逐漸減少，形態(tài)亦發(fā)生顯著改變，HUVECs體積變小、細(xì)胞質(zhì)收縮，細(xì)胞膜尚完整，但細(xì)胞內(nèi)可觀察到發(fā)泡現(xiàn)象。在2-DG作用48 h時(shí)，HUVECs經(jīng)0.6 mM 2-DG處理后，在OLYMPUS倒置顯微鏡下僅能觀察到少量細(xì)胞存活，大部分細(xì)胞與孔板底部分離、脫落，隨著2-DG濃度的增大，凋亡和壞死的細(xì)胞增多，活細(xì)胞數(shù)量更少，且有明顯的細(xì)胞損傷。

圖1 對(duì)照組12 h后細(xì)胞遷移情況圖2 9 mM 2-DG處理組12 h后細(xì)胞遷移情況圖3 對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組12 h后的細(xì)胞遷移抑制率圖4 對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組12 h后HUVECs的細(xì)胞凋亡率

Fig1 HUVECs cell migration in control group at 12 hours.Fig2 HUVECs cell migration in 9 mM 2-DG treated group at 12 hours.Fig3 Inhibition ratio (percentage) at 12 hours in the experimental and the control groups after 12 hours.Fig4 Apoptosis ratio (percentage) at 12 hours in the experimental and the control groups.

本研究結(jié)果顯示，2-DG對(duì)HUVECs的增殖、遷移和管腔形成有明顯的抑制作用，且能誘導(dǎo)其凋亡。為將2-DG用于血管瘤的防治進(jìn)行了初步的探索。

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Effectof2-Deoxy-D-glucoseonhumanumbilicalveinendothelialcell

CHENGJing,ZHANGGuan-hua,YICheng-gang,etal.
(InstituteofPlasticSurgery,XiJingHospital,TheFourthMilitaryMedicalUniversity,Xi′an710032,China)

ObjectiveTo explore the effects of 2 Deoxy D glucose on the proliferation, migration, capillary formation and apoptosis of human umbilical vein endothelial cells (HUVECs), searching a new medicine for hemangioma.MethodsMTT ,morphorlogical test and scratch test were used to detect HUVECs proliferation rate and mirgrating ability after 2-DG treatment. Tube formation matrigel assay and flow cytometry were performed for the capillary formation and endothelial apoptosis after the drug intervention respectively.ResultsAfter 2-DG was applied to HUVECs, the proliferation, migration, tube formation of HUVECs were inhibited significantly. The apoptosis rate of these cells increased and was highly time and dosage dependent.Conclusion2-DG inflicts negative effects on the proliferation and capillary formation of HUVECs, and induces apoptosis of HUVECs.

2-deoxy-glucose; Human umbilical vein endothelial cell； Hemangioma

10.3969/j.issn.1673-7040.2014.04.020

R732.2

A

1673-7040(2014)04-0248-04

2013-10-31)

710032 陜西 西安，第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院 全軍整形外科研究所

程 靜(1987-)，女，陜西咸陽(yáng)人，住院醫(yī)師，碩士研究生.

楊 力，710032，第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院 全軍整形外科研究所，電子信箱：yangli@fmmu.edu.cn