• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    氯化鈷預(yù)處理對(duì)大鼠脂肪干細(xì)胞成脂及增殖的影響

    2014-11-02 07:26:17黃佳誠(chéng)柳大烈黃子龍
    中國(guó)美容整形外科雜志 2014年4期
    關(guān)鍵詞:成脂干細(xì)胞分化

    黃佳誠(chéng), 柳大烈, 黃子龍, 南 華

    實(shí)驗(yàn)研究

    氯化鈷預(yù)處理對(duì)大鼠脂肪干細(xì)胞成脂及增殖的影響

    黃佳誠(chéng), 柳大烈, 黃子龍, 南 華

    目的觀察脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞(ADSCs)在經(jīng)氯化鈷(CoCl2)預(yù)處理的條件下,其增殖、細(xì)胞狀態(tài)變化以及成脂肪化傾向。方法通過有限稀釋法分離、培養(yǎng)SD大鼠ADSCs,取第3代ADSCs,分別向骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化鑒定,利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)大鼠ADSCs細(xì)胞表面標(biāo)志物CD29,CD34,CD44,CD45的表達(dá)。將ADSCs經(jīng)不同濃度CoCl2干預(yù),利用Western blot檢測(cè)缺氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)的表達(dá)情況。同時(shí),利用MTT實(shí)驗(yàn)來檢測(cè)大鼠ADSCs在不同濃度的CoCl2下細(xì)胞增殖的改變;并且通過油紅O定量檢測(cè)大鼠ADSCs在經(jīng)歷缺氧后的成脂情況。結(jié)果第3代ADSCs在倒置顯微鏡下觀察,大多呈梭形,經(jīng)流式鑒定,大鼠ADSCs細(xì)胞表面標(biāo)志物CD29、CD44表達(dá)率高,而CD34、CD45表達(dá)率低,體外誘導(dǎo)培養(yǎng)的大鼠ADSCs能夠向成骨細(xì)胞和成脂細(xì)胞分化,具有較高的自我更新能力。在MTT實(shí)驗(yàn)中,400、200 μmol/L CoCl2組,ADSCs增值減弱;而100、50 μmol/L CoCl2的實(shí)驗(yàn)組,缺氧造成的對(duì)細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性與空白對(duì)照組相比,沒有變化(P>0.05)。HIF-1α的表達(dá)隨著培養(yǎng)基中的CoCl2的濃度而增加。在光鏡下觀察發(fā)現(xiàn),隨著CoCl2濃度的升高以及時(shí)間的延長(zhǎng),大鼠ADSCs的成脂傾向越發(fā)明顯(P<0.001)。結(jié)論ADSCs在處于體外適量的CoCl2干預(yù)情況時(shí),其增殖并不會(huì)受到影響,并且呈顯著的增強(qiáng)其成脂傾向。

    脂肪來源干細(xì)胞; 氯化鈷; 成脂分化

    自體脂肪組織抽吸注射移植術(shù)是常見的整形手術(shù),有關(guān)提高脂肪成活率的研究一直是脂肪移植術(shù)中的重點(diǎn)。有學(xué)者提出脂肪移植術(shù)后脂肪吸收率較高的原因可能是由于脂肪組織移植后,脂肪細(xì)胞處于一個(gè)相對(duì)局部缺氧的環(huán)境從而導(dǎo)致其壞死、液化[1]。一些研究表明,在移植的脂肪組織中加入事先培養(yǎng)好的脂肪來源干細(xì)胞(adipose-derived stem cells, ADSCs)可以達(dá)到更好的臨床效果[1-2]。氯化鈷(CoCl2)是一種成熟的缺氧模型制造劑,已被廣泛用于制作體外和體內(nèi)細(xì)胞缺氧的環(huán)境[3-6]。自2013年2-8月,我們通過ADSCs經(jīng)由一個(gè)梯度的CoCl2的濃度體外培養(yǎng),檢測(cè)ADSCs在該環(huán)境下培養(yǎng)時(shí)缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxiainducible factor-1α,HIF-1α)的表達(dá),并通過MTT實(shí)驗(yàn)及油紅O染色定量檢測(cè),觀察隨著缺氧程度及缺氧時(shí)間的改變,脂肪干細(xì)胞增殖能力及成脂趨勢(shì)的變化。

    1 材料與方法

    1.1 主要試劑與儀器

    SD成年大鼠(南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供);Ⅰ型膠原酶、地塞米松、胰島素、β-甘油磷酸鈉、維生素C、1- 甲基-3- 異丙基黃嘌呤、吲哚美辛、DMEM-F12、胎牛血清(FBS)、細(xì)胞表面抗原檢測(cè)用試劑鼠抗人CD29-PE、CD34-FITC、CD44-FITC、CD45-FITC(美國(guó)BIOLEGEND公司);兔抗鼠單克隆抗體HIF-1α(美國(guó)SANTA CRUX公司);CoCl2(美國(guó)SIGMA公司);Olympus倒置顯微鏡, HERUS CO2培養(yǎng)孵箱, 超凈工作臺(tái),低溫離心機(jī), BD FACS Calibur 流式細(xì)胞儀。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1 大鼠ADSCs的獲取 無菌條件取大鼠腹股溝脂肪墊, 用PBS沖洗,超凈臺(tái)內(nèi)切碎后用加入0.1%Ⅰ型膠原酶吸管反復(fù)吹打,37 ℃孵育45 min, 加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基終止消化, 離心, 重懸細(xì)胞, 150目篩網(wǎng)過濾;再次離心后,重懸細(xì)胞,并將細(xì)胞懸液移入培養(yǎng)瓶中, 置37 ℃、5%CO2條件下靜置培養(yǎng)。24 h后即可見到有少量細(xì)胞貼壁;48 h后換液, 5~7 d 細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底后胰酶消化,擴(kuò)大培養(yǎng)。

    1.2.2 ADSCs的流式細(xì)胞儀鑒定 取培養(yǎng)至3代的細(xì)胞,PBS洗1遍,計(jì)數(shù),1×106/管分裝5管,抗體用0.1%BSA稀釋,100 μl/管,抗體室溫避光孵育1 h。流式細(xì)胞儀檢測(cè)ADSCs表面抗原的表達(dá)。

    1.2.3 ADSCs多向分化能力的檢測(cè) 選取第3 代ADSCs 接種到6孔板, 每皿5×104/ml細(xì)胞, 在37℃、5%CO2條培養(yǎng)24 h后,分別加入成骨誘導(dǎo)劑(0.1 μmol/L地塞米松、50 mg/L維生素C、10 mmol/L β-磷酸甘油鈉)或成脂誘導(dǎo)劑(0.25 μmol/L地塞米松、50 μmol/L吲哚美辛、0.5 mmol/L IBMX、10 mg/L牛胰島素),對(duì)照組為單純含10%FBS的培養(yǎng)基。每3 d換液,分別于7 d和28 d后,用茜素紅鈣鹽染色法及油紅O染色法來測(cè)定ADSCs的多向分化能力。

    1.2.4 MTT檢測(cè)不同濃度的CoCl2對(duì)細(xì)胞增殖的影響 選取第3代ADSCs接種到96孔板,每孔2000個(gè)細(xì)胞,在37 ℃、5%CO2條培養(yǎng)24 h后,分別加入CoCl2使得每個(gè)孔中CoCl2的濃度分別為0、50、100、200、400 μmol/L,并設(shè)置校零孔。然后分別在加藥6、24、48、72 h后加入20 μl的MTT試劑,然后通過酶標(biāo)儀測(cè)得其在490 nm下的OD值。

    1.2.5 Western blot檢測(cè)不同組中HIF-1α蛋白表達(dá)

    提取各組中的ADSCs蛋白,定量后添加SDS-PAGE上樣緩沖液煮沸7 min,每組上樣20 μg,經(jīng)10%SDS-PAGE凝膠電泳,濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜,5%的脫脂奶4 ℃封閉2 h,兔抗鼠HIF-1α(1∶1000) 4 ℃過夜,羊抗兔近紅外二抗4 ℃避光封閉2 h,Odyssey近紅外成像系統(tǒng)中掃描、分析。

    1.2.6 選取第3 代ADSCs 接種到6孔板, 每皿5×104/ml細(xì)胞, 在37 ℃、5%CO2條件培養(yǎng)24 h后,加入CoCl2使其濃度分別為100、50、0 μmol/L。3 d換液1次,保留其藥物濃度,每天在顯微鏡下觀察,并于7、14 d后用油紅O染色后,加入異丙醇溶液500 μl/孔,震蕩脫色10 min,使細(xì)胞內(nèi)染色甘油三酯充分溶解,酶標(biāo)儀540 nm處測(cè)光吸收值[7]。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    2 結(jié)果

    2.1 大鼠ADSCs的原代培養(yǎng)與形態(tài)學(xué)觀察

    原代ADSCs培養(yǎng)48 h換液后,即可觀察到貼壁細(xì)胞,細(xì)胞形態(tài)短小,呈長(zhǎng)梭形(圖1a)。培養(yǎng)至4 d,細(xì)胞明顯增多、變大,長(zhǎng)梭形、紡錘形形態(tài)更加明顯(圖1b)。在傳代培養(yǎng)中,細(xì)胞基本保持長(zhǎng)梭形的形態(tài)(圖1c)。

    2.2 ADSCs分化能力鑒定

    成骨誘導(dǎo)7 d后,油紅O染色可見細(xì)胞內(nèi)有鮮紅色透亮脂滴形成(圖2a)。成骨誘導(dǎo)后茜素紅染色均陽性,表明誘導(dǎo)后脂肪干細(xì)胞外基質(zhì)中有鈣結(jié)節(jié)形成(圖2b)。

    2.3 大鼠ADSCs的流式細(xì)胞儀鑒定

    流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn),ADSCs陽性表達(dá)間充質(zhì)細(xì)胞表面標(biāo)志CD29、CD44,陽性率均為90%以上,低表達(dá)造血干細(xì)胞表面標(biāo)志CD34、CD45(圖2c),表明取得的ADSCs純度較高。

    2.4 不同濃度的CoCl2對(duì)ADSCs增殖的影響

    MTT檢測(cè)發(fā)現(xiàn),加入200、400 μmol/L的CoCl2相比空白對(duì)照組,ADSCs的增殖能力受很大抑制(P<0.05);而100 μmol/L和50 μmol/L組ADSCs的增殖能力并未產(chǎn)生明顯影響(P>0.05,圖3)。

    2.5 不同濃度的CoCl2對(duì)ADSCs的HIF-1α表達(dá)的影響

    Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示,HIF-1α蛋白在50 μmol/L和100 μmol/L組中的細(xì)胞均有表達(dá),且均高于對(duì)照組的表達(dá)量(圖4)。

    2.6 不同濃度的CoCl2培養(yǎng)液對(duì)ADSCs成脂的影響

    觀察各組細(xì)胞在倒置顯微鏡下的形態(tài)發(fā)現(xiàn),相比對(duì)照組,CoCl2組呈較多脂滴(圖5)。在對(duì)照組中,通過油紅O染色后定量測(cè)量發(fā)現(xiàn),相比對(duì)照組,加入CoCl2組中的ADSCs的成脂肪趨勢(shì)更加明顯(P<0.001,表1)。

    圖1 ADSCs的形態(tài) a. 原代ADSC培養(yǎng)2 d后(×200) b. P1代ADSCs 培養(yǎng)4 d后(×100) c. P3代ADSCs培養(yǎng)4 d后(×100)圖2 脂肪干細(xì)胞的分化能力 a. ADSCs成脂誘導(dǎo)7 d后油紅O染色 (×400) b. ADSCs成骨誘導(dǎo)28 d后茜素紅染色(×200)圖3 MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)處于不同濃度的CoCl2后,不同時(shí)間ADSCs增殖能力的變化圖4 Western blotting檢測(cè)各組標(biāo)本中HIF-1α的表達(dá)圖5 培養(yǎng)14 d后,觀察光鏡下各組油紅O染色結(jié)果 a.對(duì)照組(×200) b.50 μmol/L組(×200)c.100 μmol/L組(×200)

    Fig1 ADSCs under the inverted microscope. a. original ADSCs at 2 days after culture (×200). b. P1 ADSCs at 4 days after culture (×100). c. P3 ADSCs at 4 days after culture (×100).Fig2 ADSCs differentiation a. ADSCs of adipogenic differentiation at 7 days by Oil red staining (×400). b. ADSCs of osteogenic differentiation at 7 days by Alizarin red staining (×200) .Fig3 The proliferation activity levels of ADSCs at different CoCl2concentration in each group.Fig4 The protein levels of HIF-1α in each groups.Fig5 ADSCs at 14 days after culture by Oil red staining in each groups. a. control group(×200). b. 50 μmol/L group(×200).c. 100 μmol/L group(×200).

    表1 不同濃度的CoCl2對(duì)ADSCs的成脂分化的影響Tab1 Effect of CoCl2 at different concentrations on ADSCs adipogenic differentiation n=5

    注:*主效應(yīng)的F統(tǒng)計(jì)量和P值;#交互效應(yīng)的F統(tǒng)計(jì)量和P值

    3 討論

    脂肪干細(xì)胞因具有易獲得性及不涉及倫理問題等優(yōu)點(diǎn)而成為理想的種子細(xì)胞來源[8-9]。在臨床中已有實(shí)驗(yàn)證實(shí),將脂肪干細(xì)胞混入需要移植的脂肪細(xì)胞后,能較單一的脂肪細(xì)胞注射達(dá)到更好療效[10]。從而提示我們需要探求脂肪干細(xì)胞在這樣一個(gè)相對(duì)缺氧環(huán)境中,它的增殖是否受到影響以及在這種情況下轉(zhuǎn)歸如何。

    目前,國(guó)內(nèi)外一些研究表明,將用于治療的間充質(zhì)干細(xì)胞事先經(jīng)過一定程度的預(yù)缺氧,可以得到更好的治療效果,并提出這可能是由于細(xì)胞內(nèi)的HIF-1的調(diào)節(jié)[11-13]。HIF-1分為HIF-1α和HIF-1β的形式存在,其中HIF-1α屬于功能性亞基,HIF-1β屬于結(jié)構(gòu)性亞基,HIF-1α亞基的表達(dá)活性決定了HIF-1的生理活性,因此,HIF-1α在調(diào)控組織中氧代謝的適應(yīng)反應(yīng)中起重要作用。目前,已經(jīng)明確的受缺氧誘導(dǎo)因子1調(diào)控的靶基因有100多個(gè)[2,14]。研究表明,這些靶基因影響著干細(xì)胞的增殖、分化、遷移等[15-18]。本研究發(fā)現(xiàn),ADSCs在50 μmol/L和100 μmol/L的CoCl2的缺氧環(huán)境下,HIF-1α蛋白的表達(dá)均高于不缺氧組,即在該濃度的缺氧環(huán)境下,可以誘導(dǎo)HIF-1α蛋白的表達(dá)。

    CoCl2是一種成熟的缺氧模型介導(dǎo)試劑,已被廣泛應(yīng)用在體外和體內(nèi)激活HiF-α[3-6]。所以,有必要探求脂肪干細(xì)胞在增殖及轉(zhuǎn)歸過程中是否受到CoCl2濃度的影響,于是我們通過讓ADSCs處于含有梯度CoCl2濃度的培養(yǎng)環(huán)境,采用MTT檢測(cè)他們的增殖率。我們可以發(fā)現(xiàn),脂肪干細(xì)胞只有在處于200、400 μmol/L這樣的培養(yǎng)環(huán)境,才會(huì)出現(xiàn)增值減弱和死亡的現(xiàn)象。低濃度CoCl2的培養(yǎng)環(huán)境并不會(huì)對(duì)ADSCs的增值產(chǎn)生影響。而且,通過Western blotting我們證明了CoCl2能使HIF-1α的表達(dá)隨著其濃度的升高而上升。ADSCs具有穩(wěn)定擴(kuò)增的特性,在正常體外環(huán)境培養(yǎng)時(shí),并不會(huì)表現(xiàn)出特定的分化傾向。我們的研究表明,ADSCs在CoCl2環(huán)境下培養(yǎng)時(shí),隨著濃度的提高,脂肪干細(xì)胞的成脂傾向越發(fā)明顯。我們使用了經(jīng)過MTT試驗(yàn)得出的對(duì)ADSCs增殖沒有影響的0、50、100 μmol/L這3個(gè)組,在沒有加入成脂誘導(dǎo)劑量的情況下,在50 μmol/L組中我們可以觀察到脂肪干細(xì)胞發(fā)生了明顯的自體成脂傾向,而對(duì)照組中則沒有改變,同時(shí)隨著CoCl2的濃度的上升,100 μmol/L脂肪干細(xì)胞的成脂趨勢(shì)會(huì)顯得更快更加明顯。這提示我們?cè)谶M(jìn)行含有脂肪干細(xì)胞的脂肪移植術(shù)中,移植的脂肪干細(xì)胞由于處于一定的缺氧環(huán)境,脂肪干細(xì)胞可能會(huì)具有一種成脂分化的趨勢(shì),并且它的增殖并沒有受到影響。這也可能是由于缺氧誘導(dǎo)因子HiF-α調(diào)控靶基的結(jié)果,從而使脂肪干細(xì)胞能夠快速增殖并分化為成熟的脂肪細(xì)胞,并使術(shù)后效果較單一的脂肪移植術(shù)好。因此,在進(jìn)行含有脂肪干細(xì)胞的脂肪移植術(shù)時(shí),事先將脂肪干細(xì)胞進(jìn)行一定的預(yù)缺氧處理可能會(huì)取得更好的臨床療效。

    本實(shí)驗(yàn)通過體外實(shí)驗(yàn)比較了不同濃度的CoCl2對(duì)ADCSs增殖及分化的影響,由此顯示,適當(dāng)?shù)腃oCl2培養(yǎng)環(huán)境會(huì)刺激脂肪干細(xì)胞的成脂分化能力并且不影響其增殖。但是,究竟通過哪些信號(hào)通路并且通過什么樣的方式調(diào)整還有待于進(jìn)一步地研究。

    [1] 付冰川, 高建華, 魯 峰, 等. 新鮮分離的脂肪SVF細(xì)胞促進(jìn)脂肪移植存活的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 中華整形外科雜志, 2010,26(4):289-294.

    [2] Schumacker PT. Hypoxia inducible factor 1(HIF-1)[J]. Crit Care Med, 2005,33(12 Suppl):S423-S425.

    [3] Pacary E, Legros H, Valable S, et al. Synergistic effects of CoCl(2) and ROCK inhibition on mesenchymal stem cell differentiation into neuron-like cells[J]. J Cell Sci, 2006,119 (Pt 13):2667-2678.

    [4] Kim KS, Rajagopal V, Gonsalves C, et al. A novel role of hypoxia-inducible factor in cobalt chloride-and hypoxia-mediated expression of IL-8 chemokine in human endothelial cells[J]. J Immunol, 2006,177(10):7211-7224.

    [5] Tanaka T, Kojima I, Ohse T, et al. Cobalt promotes angiogenesis via hypoxia-inducible factor and protects tubulointerstitium in the remnant kidney model[J]. Lab Invest, 2005,85(10):1292-1307.

    [6] Song YR, You SJ, Lee YM, et al. Activation of hypoxia-inducible factor attenuates renal injury in rat remnant kidney[J]. Nephrol Dial Transplant, 2010,25(1):77-85.

    [7] Sen A, Lea-Currie YR, Sujkowaka D, et al. Adipogenic potential of human adipose derived stromal cells from multiple donors is heterogeneous[J]. J Cell Biochem, 2001,81(2):312-319.

    [8] Sagrinati C, Ronconi E, Lazzeri E, et al. Stem-cell approaches for kidney repair: choosing the right cells[J]. Trends Mol Med, 2008,14(7):277-285.

    [9] Le Blanc K. Immunomodulatory effects of fetal and adult mesenchymal stem cells[J]. Cytotherapy, 2003,5(6):485-489.

    [10] 曹孟君, 錢奕煒, 宋富貴, 等. 自體脂肪干細(xì)胞輔助脂肪移植77例分析[J]. 中國(guó)美容整形外科雜志, 2012,23(6):335-338.

    [11] Liu H, Liu S, Li Y, et al. The role of SDF-1-CXCR4/CXCR7 axis in the therapeutic effects of hypoxia-preconditioned mesenchymal stem cells for renal ischemia/reperfusion injury[J]. PLoS One, 2012,7(4):e34608.

    [12] Yamamoto Y, Fujita M, Tanaka Y, et al. Low oxygen tension enhances proliferation and maintains stemness of adipose tissue-derived stromal cells[J]. Biores Open Access, 2013,2(3):199-205.

    [13] Yu X, Lu C, Liu H, et al. Hypoxic preconditioning with cobalt of bone marrow mesenchymal stem cells improves cell migration and enhances therapy for treatment of ischemic acute kidney inju-ry[J]. PLoS One, 2013,8(5):e62703.

    [14] Adams JM, Difazio LT, Rolandelli RH, et al. HIF-1: a key mediator in hypoxia[J]. Acta Physiol Hung, 2009,96(1):19-28.

    [15] Wang Y, Tang Z, Xue R, et al. Differential response to CoCl2-stimulated hypoxia on HIF-1α, VEGF, and MMP-2 expression in ligament cells[J]. Mol Cell Biochem, 2012,360(1-2):235-242.

    [16] Dong N, Qin W, Xue Y, et al. Hypoxia affects in vitro proliferation and differentiation of mouse corneal epithelial progenitor cell[J]. In Vitro Cell Dev Biol Anim, 2013,49(7):508-514.

    [17] Przybyt E, Krenning G, Brinker MG, et al. Adipose stromal cells primed with hypoxia and inflammation enhance cardiomyocyte proliferation rate in vitro through STAT3 and Erk1/2[J]. J Transl Med, 2013,11:39.

    [18] Ratajczak MZ, Zuba-Surma E, Kucia M, et al. The pleiotropic effects of the SDF-1-CXCR4 axis in organogenesis, regeneration and tumorigenesis[J]. Leukemia, 2006,20(11):1915-1924.

    Effectofcobaltchloridepreprocessingontheproliferationandadipogenicdifferentiationofratadipose-derivedstemcells

    HUANGJia-cheng,LIUDa-lie,HUANGZi-long,etal.
    (DepartmentofPlasticandCosmeticSurgery,ZhuJiangHospital,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510282,China)

    ObjectiveTo observe the effect of cobalt chloride(Cocl2) preprocessing on the proliferation and adipogenic differentiation of rat adipose-derived stem cells(ADSCs).MethodsRat ADSCs were isolated from adipose tissue obtained from rat and were cultured, ADSCs at Passage 3 were cultured in adipogenic, osteogenetic differentiation medium and underwent identification, flow cytometric analysis for cell surface antigen CD29, CD34, CD44 and CD45 were performed. To confirm the effect of cobalt chloride preprocessing on adipogenic differentiation of ADSCs, CoCl2, a HIF stabilizer was used to mimic the hypoxic condition. The expression of HIF-1α were observed by Western blotting. Growth condition of the cells was observed by inverted microscope. MTT method was used to observe cell proliferation activity at different concentrations after hypoxic culture. The effects of hypoxic condition to ADSCs adipogenic differentiation was detected by Oil Red O quantitative assay.ResultsMost ADSCs at Passage 3 were spindle-shaped under the inverted microscope. Flow cytometric analysis showed CD29 and CD44 were positive; CD 34 and CD45 were negative. ADSCs were induced in vitro to osteoblasts and lipoblasts. MTT method revealed the Optical Density value of 100 and 50 μmol/L-1CoCl2and control group were no significant differences between each groups (P>0.05). HIF-1 alpha protein was increased with the CoCl2concentration increasing. At 7th and 14th days after hypoxia culture, Oil Red O quantitative assay showed hypoxia had a significant impact on ADSCs adipogenic capacity (P<0.001).ConclusionCobalt chloride preprocessing condition will enhance the adipogenic differentiation ability of ADSCs and proliferation activity will not be affected.

    ADSCs; Cobalt chloride; Adipogenic differentiation

    10.3969/j.issn.1673-7040.2014.04.016

    R332

    A

    1673-7040(2014)04-0235-05

    2013-11-18)

    國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81171831)

    510282 廣東 廣州,南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院 整形美容外科

    黃佳誠(chéng)(1987-),男,江蘇泰州人,碩士研究生.

    柳大烈,510282,南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院 整形美容外科,電子信箱:liudalie@hotmail.com

    猜你喜歡
    成脂干細(xì)胞分化
    干細(xì)胞:“小細(xì)胞”造就“大健康”
    兩次中美貨幣政策分化的比較及啟示
    分化型甲狀腺癌切除術(shù)后多發(fā)骨轉(zhuǎn)移一例
    造血干細(xì)胞移植與捐獻(xiàn)
    左、右歸丸對(duì)去卵巢大鼠BMSCs成骨、成脂分化后Caspase-3/Bcl-2的影響
    中成藥(2017年10期)2017-11-16 00:49:52
    干細(xì)胞產(chǎn)業(yè)的春天來了?
    大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞原代培養(yǎng)及成骨成脂分化能力染色鑒定
    豬BMSCs成脂分化中細(xì)胞膜鈣離子通道、鈣敏感受體及成脂定向相關(guān)基因表達(dá)研究
    納米氧化鈰顆粒對(duì)骨髓基質(zhì)細(xì)胞成骨分化和成脂分化的影響
    干細(xì)胞治療有待規(guī)范
    日韩欧美国产在线观看| 成人国语在线视频| 老熟妇仑乱视频hdxx| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 色综合亚洲欧美另类图片| 亚洲在线自拍视频| 欧美乱妇无乱码| 18禁国产床啪视频网站| 国产熟女午夜一区二区三区| 免费av毛片视频| 欧美午夜高清在线| 亚洲三区欧美一区| 日本三级黄在线观看| 免费看十八禁软件| 午夜视频精品福利| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 波多野结衣一区麻豆| 国产亚洲欧美在线一区二区| 色综合婷婷激情| a级毛片在线看网站| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 亚洲五月色婷婷综合| 我的亚洲天堂| 一本久久中文字幕| 美女午夜性视频免费| 无限看片的www在线观看| 国产精品亚洲av一区麻豆| 黄色视频,在线免费观看| 精品人妻1区二区| 搡老熟女国产l中国老女人| 国产区一区二久久| 日本a在线网址| av在线播放免费不卡| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 亚洲一码二码三码区别大吗| 国产又爽黄色视频| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 免费不卡黄色视频| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 在线永久观看黄色视频| 午夜视频精品福利| 老司机在亚洲福利影院| 日日爽夜夜爽网站| 亚洲成国产人片在线观看| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 久久婷婷人人爽人人干人人爱 | 国产欧美日韩一区二区三区在线| 真人做人爱边吃奶动态| 夜夜夜夜夜久久久久| 免费人成视频x8x8入口观看| АⅤ资源中文在线天堂| 老熟妇仑乱视频hdxx| 女性被躁到高潮视频| 成人亚洲精品av一区二区| a在线观看视频网站| 变态另类丝袜制服| 人人妻人人澡欧美一区二区 | 91麻豆精品激情在线观看国产| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 黄色毛片三级朝国网站| 成人国语在线视频| 在线观看午夜福利视频| 精品人妻在线不人妻| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 真人做人爱边吃奶动态| 国产高清videossex| 一区在线观看完整版| 精品人妻在线不人妻| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 正在播放国产对白刺激| 波多野结衣一区麻豆| 日韩三级视频一区二区三区| 精品人妻1区二区| 午夜免费鲁丝| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 制服丝袜大香蕉在线| 国产精品香港三级国产av潘金莲| av免费在线观看网站| 一级毛片高清免费大全| 亚洲免费av在线视频| 一区二区三区精品91| 国产精品二区激情视频| 精品电影一区二区在线| 午夜免费鲁丝| 性欧美人与动物交配| 国产精品av久久久久免费| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 在线观看免费视频日本深夜| 免费在线观看日本一区| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 日本 欧美在线| 不卡一级毛片| 少妇被粗大的猛进出69影院| 不卡av一区二区三区| 日本vs欧美在线观看视频| 亚洲人成77777在线视频| 午夜影院日韩av| 国产成人免费无遮挡视频| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 欧美精品亚洲一区二区| 丝袜美足系列| 两个人看的免费小视频| 99久久综合精品五月天人人| 一级作爱视频免费观看| 久久精品国产亚洲av高清一级| 国产一区二区三区综合在线观看| 丰满的人妻完整版| 亚洲欧美日韩无卡精品| 国产一区在线观看成人免费| 97人妻精品一区二区三区麻豆 | 一本综合久久免费| 亚洲伊人色综图| 嫩草影院精品99| 禁无遮挡网站| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 国产精品国产高清国产av| 国产精品久久久av美女十八| 中国美女看黄片| 91大片在线观看| 久久精品91蜜桃| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 99久久国产精品久久久| 一本综合久久免费| 免费av毛片视频| a在线观看视频网站| 最近最新中文字幕大全电影3 | 亚洲伊人色综图| 日韩欧美免费精品| 国产成人欧美在线观看| www.www免费av| 人妻久久中文字幕网| 黄色片一级片一级黄色片| 俄罗斯特黄特色一大片| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 欧美日韩精品网址| 亚洲精品国产一区二区精华液| 这个男人来自地球电影免费观看| 午夜福利,免费看| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 天堂动漫精品| 亚洲国产精品999在线| 老司机靠b影院| 丝袜在线中文字幕| 免费无遮挡裸体视频| 亚洲精品国产色婷婷电影| 午夜亚洲福利在线播放| 午夜福利免费观看在线| 99在线人妻在线中文字幕| 欧美黑人欧美精品刺激| 两个人免费观看高清视频| 国产真人三级小视频在线观看| 18禁观看日本| 久久久久亚洲av毛片大全| 久久人人97超碰香蕉20202| 嫩草影视91久久| 神马国产精品三级电影在线观看 | 国产成人欧美在线观看| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 国产精品久久久av美女十八| 亚洲精品粉嫩美女一区| 久久久久久久久久久久大奶| www.熟女人妻精品国产| 亚洲 国产 在线| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 亚洲国产欧美一区二区综合| 丁香六月欧美| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 操出白浆在线播放| 欧美日韩精品网址| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 无人区码免费观看不卡| 女人被狂操c到高潮| 午夜久久久久精精品| 久久影院123| 老司机午夜福利在线观看视频| 91麻豆av在线| 久久午夜综合久久蜜桃| netflix在线观看网站| 欧美精品亚洲一区二区| 日韩欧美国产一区二区入口| 国产主播在线观看一区二区| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 最近最新中文字幕大全免费视频| 一边摸一边抽搐一进一小说| 一进一出抽搐动态| 精品一区二区三区av网在线观看| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 国产精品日韩av在线免费观看 | 亚洲av美国av| 久久久国产成人精品二区| 欧美精品亚洲一区二区| 大陆偷拍与自拍| 亚洲国产中文字幕在线视频| 午夜免费成人在线视频| 黄片大片在线免费观看| 国产免费男女视频| АⅤ资源中文在线天堂| 欧美另类亚洲清纯唯美| 欧美+亚洲+日韩+国产| 国产亚洲精品久久久久5区| 高清在线国产一区| 涩涩av久久男人的天堂| tocl精华| 欧美日韩精品网址| 嫩草影院精品99| 伦理电影免费视频| 欧美日本亚洲视频在线播放| 久久午夜亚洲精品久久| 岛国在线观看网站| 国产精品九九99| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 久久精品91蜜桃| 免费看美女性在线毛片视频| 日韩大尺度精品在线看网址 | 国产片内射在线| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 色精品久久人妻99蜜桃| 老司机深夜福利视频在线观看| 精品国产美女av久久久久小说| 久99久视频精品免费| 亚洲最大成人中文| 国产黄a三级三级三级人| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 亚洲电影在线观看av| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 一级毛片女人18水好多| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 97人妻天天添夜夜摸| 成人亚洲精品一区在线观看| 最新美女视频免费是黄的| 国产精品影院久久| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 国产亚洲精品一区二区www| 日韩欧美三级三区| 成人亚洲精品av一区二区| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 高清毛片免费观看视频网站| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 午夜精品久久久久久毛片777| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 日日夜夜操网爽| 真人做人爱边吃奶动态| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 男人舔女人的私密视频| 国产精品二区激情视频| 国产精品久久视频播放| 欧美中文日本在线观看视频| 窝窝影院91人妻| 国产亚洲av高清不卡| 国产成人系列免费观看| 亚洲精品美女久久av网站| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 免费不卡黄色视频| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 欧美一区二区精品小视频在线| 亚洲激情在线av| 青草久久国产| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 91av网站免费观看| 99久久99久久久精品蜜桃| 1024香蕉在线观看| 午夜福利成人在线免费观看| 波多野结衣高清无吗| 欧美成人一区二区免费高清观看 | 久久香蕉国产精品| 国产精品 欧美亚洲| 久久久久亚洲av毛片大全| 这个男人来自地球电影免费观看| 欧美不卡视频在线免费观看 | 中文字幕人妻丝袜一区二区| 亚洲男人的天堂狠狠| 自线自在国产av| 91国产中文字幕| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 成年女人毛片免费观看观看9| 999精品在线视频| 男女之事视频高清在线观看| 国产伦一二天堂av在线观看| 久久久久久久午夜电影| 精品国产乱子伦一区二区三区| 日本 av在线| 国产97色在线日韩免费| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 嫁个100分男人电影在线观看| 又黄又粗又硬又大视频| 亚洲av成人av| 99久久精品国产亚洲精品| 国产亚洲av高清不卡| 国产精品日韩av在线免费观看 | 嫩草影视91久久| 国产高清有码在线观看视频 | 在线av久久热| 久久久久久人人人人人| 99香蕉大伊视频| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 狠狠狠狠99中文字幕| 精品久久久久久久人妻蜜臀av | 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 国产三级在线视频| 亚洲欧美激情综合另类| 好男人电影高清在线观看| 国产av又大| 在线观看66精品国产| 男女之事视频高清在线观看| 不卡av一区二区三区| 日本精品一区二区三区蜜桃| 一本久久中文字幕| avwww免费| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 久久久国产成人精品二区| 搞女人的毛片| avwww免费| 一本久久中文字幕| 男男h啪啪无遮挡| 国产男靠女视频免费网站| 高清黄色对白视频在线免费看| 日韩欧美在线二视频| 免费无遮挡裸体视频| 一区二区日韩欧美中文字幕| 欧美乱妇无乱码| 亚洲国产欧美网| av欧美777| 免费看十八禁软件| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 老熟妇仑乱视频hdxx| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 极品人妻少妇av视频| 女性被躁到高潮视频| 国产91精品成人一区二区三区| 午夜老司机福利片| 国产亚洲精品综合一区在线观看 | 变态另类成人亚洲欧美熟女 | 午夜成年电影在线免费观看| 精品不卡国产一区二区三区| 午夜福利一区二区在线看| 两性夫妻黄色片| 真人做人爱边吃奶动态| 久久婷婷成人综合色麻豆| 成在线人永久免费视频| 国产精品久久电影中文字幕| 亚洲成人免费电影在线观看| 一二三四社区在线视频社区8| 午夜精品在线福利| 国产成人免费无遮挡视频| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 丝袜人妻中文字幕| 欧美最黄视频在线播放免费| 亚洲伊人色综图| 狠狠狠狠99中文字幕| 精品国产乱子伦一区二区三区| 国产av在哪里看| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 亚洲男人的天堂狠狠| 纯流量卡能插随身wifi吗| 久久久国产精品麻豆| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| avwww免费| 婷婷丁香在线五月| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 国产亚洲精品第一综合不卡| 中出人妻视频一区二区| 国产一区在线观看成人免费| 国产精品 欧美亚洲| 精品人妻在线不人妻| 91麻豆av在线| 午夜福利欧美成人| 亚洲国产中文字幕在线视频| 国产av一区二区精品久久| 色尼玛亚洲综合影院| 久久亚洲精品不卡| 国产片内射在线| 午夜免费观看网址| 日韩欧美国产在线观看| 99国产精品免费福利视频| 国产精品一区二区免费欧美| 天堂动漫精品| 男男h啪啪无遮挡| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 丁香六月欧美| 欧美黄色片欧美黄色片| 色av中文字幕| 亚洲国产精品合色在线| 色综合亚洲欧美另类图片| 青草久久国产| 天天一区二区日本电影三级 | 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 国产精品亚洲一级av第二区| 一个人免费在线观看的高清视频| 日本三级黄在线观看| 精品国产亚洲在线| or卡值多少钱| 日韩欧美国产在线观看| 美女大奶头视频| 禁无遮挡网站| 欧美激情久久久久久爽电影 | 亚洲国产欧美网| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 国产熟女午夜一区二区三区| 在线国产一区二区在线| 在线观看一区二区三区| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 成人国产综合亚洲| 久久中文看片网| 亚洲精品久久国产高清桃花| 真人做人爱边吃奶动态| 精品国产一区二区三区四区第35| 久久午夜亚洲精品久久| 一本大道久久a久久精品| 午夜a级毛片| 日本一区二区免费在线视频| 国产伦一二天堂av在线观看| 精品国产美女av久久久久小说| 母亲3免费完整高清在线观看| 看片在线看免费视频| 久久国产乱子伦精品免费另类| 国产亚洲av嫩草精品影院| 啦啦啦观看免费观看视频高清 | 中文字幕久久专区| 欧美激情极品国产一区二区三区| av电影中文网址| 18禁美女被吸乳视频| 欧美激情久久久久久爽电影 | 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 极品人妻少妇av视频| 亚洲美女黄片视频| 大码成人一级视频| avwww免费| √禁漫天堂资源中文www| 男女做爰动态图高潮gif福利片 | 午夜a级毛片| 亚洲avbb在线观看| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 国产亚洲精品综合一区在线观看 | 一二三四社区在线视频社区8| 国产激情欧美一区二区| 香蕉丝袜av| 超碰成人久久| a在线观看视频网站| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 午夜老司机福利片| 国产不卡一卡二| 国产精品一区二区免费欧美| 色综合站精品国产| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 大型av网站在线播放| 亚洲第一av免费看| 美女大奶头视频| 精品熟女少妇八av免费久了| 欧美国产精品va在线观看不卡| 99国产综合亚洲精品| 国内精品久久久久精免费| 午夜a级毛片| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 精品国产亚洲在线| 最近最新免费中文字幕在线| 亚洲午夜理论影院| 欧美激情 高清一区二区三区| 亚洲国产精品久久男人天堂| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 99riav亚洲国产免费| 搞女人的毛片| 国产一区二区激情短视频| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 国内精品久久久久久久电影| 嫩草影视91久久| 精品欧美一区二区三区在线| 国产91精品成人一区二区三区| 成人欧美大片| av在线天堂中文字幕| www日本在线高清视频| 中国美女看黄片| 免费在线观看影片大全网站| 欧美中文日本在线观看视频| 宅男免费午夜| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 久久人妻熟女aⅴ| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 高清毛片免费观看视频网站| 国产精品免费视频内射| 长腿黑丝高跟| 日韩av在线大香蕉| 香蕉久久夜色| av有码第一页| 黄色a级毛片大全视频| 亚洲久久久国产精品| 亚洲情色 制服丝袜| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 欧美日本亚洲视频在线播放| 国产麻豆69| 丝袜在线中文字幕| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 一a级毛片在线观看| 国内精品久久久久精免费| 免费高清在线观看日韩| 变态另类成人亚洲欧美熟女 | 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 欧美日韩福利视频一区二区| 丁香欧美五月| 久久热在线av| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 国产成人av激情在线播放| 亚洲人成77777在线视频| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 97碰自拍视频| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 久久久久久国产a免费观看| 天天一区二区日本电影三级 | 精品久久久久久,| 级片在线观看| 淫秽高清视频在线观看| 97人妻天天添夜夜摸| 免费在线观看黄色视频的| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 欧美久久黑人一区二区| 制服丝袜大香蕉在线| 精品不卡国产一区二区三区| aaaaa片日本免费| 免费av毛片视频| 丁香六月欧美| 夜夜爽天天搞| 欧美+亚洲+日韩+国产| 99久久综合精品五月天人人| 国产欧美日韩精品亚洲av| 亚洲专区字幕在线| 91国产中文字幕| 日韩成人在线观看一区二区三区| 91老司机精品| 性色av乱码一区二区三区2| 久久久久久免费高清国产稀缺| 欧美色欧美亚洲另类二区 | 国产成人免费无遮挡视频| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 婷婷六月久久综合丁香| 怎么达到女性高潮| 制服丝袜大香蕉在线| 身体一侧抽搐| 校园春色视频在线观看| 十八禁网站免费在线| 757午夜福利合集在线观看| 国产av又大| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 看免费av毛片| 99国产精品一区二区蜜桃av| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 日本三级黄在线观看| 精品久久久久久久毛片微露脸| 亚洲专区国产一区二区| 两人在一起打扑克的视频| 久久婷婷人人爽人人干人人爱 | 色精品久久人妻99蜜桃| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 天堂影院成人在线观看| 亚洲性夜色夜夜综合| 久久香蕉精品热| av片东京热男人的天堂| 久久中文看片网| 国产伦一二天堂av在线观看| 男人操女人黄网站| 久久狼人影院| 国产精品电影一区二区三区| 最近最新免费中文字幕在线| 国产男靠女视频免费网站| 91大片在线观看| 亚洲av第一区精品v没综合| 国产高清视频在线播放一区| svipshipincom国产片| 久久久久久久午夜电影| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 操美女的视频在线观看| 国产一卡二卡三卡精品| 国产精品亚洲美女久久久| 给我免费播放毛片高清在线观看| 日韩成人在线观看一区二区三区| 亚洲色图综合在线观看| 久久亚洲真实| 神马国产精品三级电影在线观看 | 成人亚洲精品av一区二区| 国产一区二区在线av高清观看| 一级a爱视频在线免费观看| 亚洲免费av在线视频| 深夜精品福利| 亚洲色图av天堂| 免费不卡黄色视频| 男女床上黄色一级片免费看| 亚洲色图av天堂| e午夜精品久久久久久久| 一二三四社区在线视频社区8| 欧美不卡视频在线免费观看 | 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 在线观看一区二区三区| 91在线观看av| 亚洲成av人片免费观看| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 亚洲国产欧美网| 青草久久国产| 国产主播在线观看一区二区| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 国产av又大| 国产免费av片在线观看野外av| 在线观看舔阴道视频| 午夜精品在线福利| 久久婷婷人人爽人人干人人爱 | 大香蕉久久成人网| 日韩成人在线观看一区二区三区| 日日摸夜夜添夜夜添小说| www.www免费av| 97人妻精品一区二区三区麻豆 |