應(yīng)用改良擴(kuò)張器構(gòu)建大鼠皮膚軟組織擴(kuò)張模型

楊登峰， 馬 靜， 蘇映軍， 宋雅娟， 余 州， 雷 蕾， 馬顯杰

實(shí)驗(yàn)研究

應(yīng)用改良擴(kuò)張器構(gòu)建大鼠皮膚軟組織擴(kuò)張模型

楊登峰， 馬 靜， 蘇映軍， 宋雅娟， 余 州， 雷 蕾， 馬顯杰

目的應(yīng)用改良設(shè)計(jì)的短注射導(dǎo)管枕形擴(kuò)張器構(gòu)建大鼠皮膚軟組織擴(kuò)張模型，并探討其產(chǎn)生的擴(kuò)張應(yīng)力對大鼠皮膚細(xì)胞增殖分化的影響，驗(yàn)證擴(kuò)張模型的擴(kuò)張效果，為研究擴(kuò)張皮膚新生機(jī)制提供一個穩(wěn)定的動物模型。方法SD大鼠隨機(jī)分為A、B兩組(每組各30只)，A組大鼠采用改良設(shè)計(jì)的擴(kuò)張器，B組大鼠采用上海威寧公司生產(chǎn)的普通擴(kuò)張器；選擇SD大鼠近頸部切口，以注射壺外置的方式埋置擴(kuò)張器，制作皮膚軟組織擴(kuò)張模型。分別采集A組在不同擴(kuò)張時(shí)間點(diǎn)(1、2、3、4、5周)的擴(kuò)張中心區(qū)域皮膚和正常皮膚組織作為標(biāo)本；利用HE染色方法觀察擴(kuò)張后皮膚結(jié)構(gòu)的變化；根據(jù)增殖細(xì)胞表達(dá)增殖細(xì)胞核抗原，采用免疫組織化學(xué)染色方法觀察擴(kuò)張皮膚中細(xì)胞增殖的情況。結(jié)果A組應(yīng)用自行改良設(shè)計(jì)的擴(kuò)張器，選擇大鼠近頸部切口構(gòu)建的皮膚軟組織擴(kuò)張模型，術(shù)后外置的注射壺不易被大鼠咬掉，且術(shù)后注水及護(hù)理更簡單，模型穩(wěn)定性顯著高于B組。HE染色結(jié)果表明，擴(kuò)張后皮膚的表皮層明顯增厚，真皮層變薄；免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，增殖細(xì)胞呈點(diǎn)狀分布，主要集中于表皮基底層和毛囊鞘。結(jié)論自行改良設(shè)計(jì)的短注射導(dǎo)管枕形擴(kuò)張器，是構(gòu)建大鼠皮膚軟組織擴(kuò)張模型的良好實(shí)驗(yàn)材料；擴(kuò)張應(yīng)力對大鼠的皮膚結(jié)構(gòu)和增殖產(chǎn)生了影響。

皮膚軟組織擴(kuò)張術(shù)； 動物模型； 擴(kuò)張器； 皮膚增殖

皮膚軟組織擴(kuò)張術(shù)早已成為整形外科領(lǐng)域最為常用的治療手段之一，因其具有良好的修復(fù)效果，深受醫(yī)師和患者的歡迎[1]，但也存在治療周期較長的缺點(diǎn)。如何在盡量短的時(shí)間內(nèi)擴(kuò)張出面積大、質(zhì)量好的新增皮膚成為研究努力的方向[2]。要想通過干預(yù)措施，提高擴(kuò)張效率，就得通過實(shí)驗(yàn)研究來闡明擴(kuò)張皮膚組織增生的機(jī)制，首先需要建立一個良好穩(wěn)定的皮膚軟組織擴(kuò)張動物模型。自2012年12月至2013年4月，我們采用一種自行改良設(shè)計(jì)的短注射導(dǎo)管枕形擴(kuò)張器，使其更適合構(gòu)建鼠的皮膚軟組織擴(kuò)張模型，并通過HE染色進(jìn)行組織學(xué)觀察、增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)免疫組織化學(xué)染色，觀察擴(kuò)張應(yīng)力對皮膚細(xì)胞增殖的影響，驗(yàn)證其擴(kuò)張效果。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料、實(shí)驗(yàn)動物及擴(kuò)張模型的制備、分組與標(biāo)本采集

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料與實(shí)驗(yàn)動物 自行改良設(shè)計(jì)的短注射導(dǎo)管枕形擴(kuò)張器(20 ml)，注射導(dǎo)管長約1.5 cm(陜西咸陽硅橡膠制品廠制作；專利號：ZL201320034912.1)，見圖1；普通圓形擴(kuò)張器，注射導(dǎo)管長約6 cm(上海威寧整形制品有限公司)，見圖2。7周齡SD大鼠60只(由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供)。

1.1.2 擴(kuò)張模型的制備、分組與標(biāo)本采集 ①手術(shù)方法： 2%戊巴比妥鈉溶液腹腔注射麻醉，碘伏消毒背部皮膚，以脊柱為中線，在背部皮膚表面用亞甲藍(lán)標(biāo)記擬埋置擴(kuò)張器的邊界，在近頸部垂直于脊柱線橫行切開全層皮膚，切口長約1.5 cm；用剝離剪在深筋膜淺層鈍性分離預(yù)擴(kuò)張的區(qū)域，剝離范圍不超過標(biāo)記線，形成組織腔隙，鹽水濕紗布填塞止血；分別置入自行改良設(shè)計(jì)的短注射導(dǎo)管枕形擴(kuò)張器或威寧公司生產(chǎn)的普通擴(kuò)張器，注射壺外置，全層縫合切口，最后將注射壺再次單獨(dú)打結(jié)固定于頸部皮膚。術(shù)后動物單籠喂養(yǎng)，無須限制其活動，見圖3。②實(shí)驗(yàn)動物分組與標(biāo)本采集：A組埋置自行改良設(shè)計(jì)的短注射導(dǎo)管枕形擴(kuò)張器，B組埋置上海威寧公司生產(chǎn)的普通擴(kuò)張器，各30只。分別于手術(shù)后第1天開始注水，注水1 ml/d，直至注滿20 ml。A組分別于術(shù)后第1、2、3、4、5周在擴(kuò)張區(qū)域皮膚中心部位切取1.0 cm×1.0 cm的皮膚組織，并切取正常未擴(kuò)張的皮膚組織做對照，標(biāo)本置于10%福爾馬林溶液中固定，常規(guī)石蠟包埋與切片，切片厚度4 μm。

1.2 觀察指標(biāo)

1.2.1 擴(kuò)張模型穩(wěn)定性的比較 統(tǒng)計(jì)A、B兩組擴(kuò)張器在整個擴(kuò)張過程中發(fā)生注射壺被鼠咬掉的個數(shù)，計(jì)算模型構(gòu)建成功的百分率，比較兩組模型構(gòu)建的穩(wěn)定性。

圖1 自行改良設(shè)計(jì)的擴(kuò)張器圖2 上海威寧公司生產(chǎn)的普通擴(kuò)張器圖3 擴(kuò)張動物模型 a.脫毛前 b.脫毛后

Fig1 Improved expander.Fig2 Ordinary expander (Shanghai Winner company).Fig3 Animal model of skin and soft tissue expansion. a. before depilation. b. after depilation.

1.2.2 組織學(xué)觀察 取A組各擴(kuò)張時(shí)間點(diǎn)和正常皮膚組織石蠟切片，進(jìn)行常規(guī)的脫蠟和水化，HE染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察，比較各擴(kuò)張時(shí)間點(diǎn)皮膚組織和正常皮膚組織的外形、表皮和真皮厚度、表皮層細(xì)胞數(shù)目、排列層次、分布特征及真皮層膠原纖維排列的變化規(guī)律。

1.2.3 免疫組織化學(xué)染色 取A組各擴(kuò)張時(shí)間點(diǎn)和正常皮膚組織石蠟切片，根據(jù)增殖細(xì)胞表達(dá)增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)，免疫組織化學(xué)染色(SP法)：以兔抗大鼠PCNA IgG單克隆抗體(美國ABCAM公司，工作濃度為1∶1000)為一抗，即用型快捷免疫組化MaxVisionTM試劑盒(兔，福州邁新)，DAB顯色試劑盒(×20，福州邁新)進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，并以PBS代替一抗作為陰性對照。以細(xì)胞核呈棕黃色著色為陽性細(xì)胞，觀察A組各擴(kuò)張時(shí)間點(diǎn)皮膚組織中陽性細(xì)胞的分布，雙盲法在200倍光學(xué)顯微鏡下，每張切片隨機(jī)選取10個視野，采用Image Pro Plus(IPP)6.0圖像分析軟件進(jìn)行免疫組織化學(xué)定量分析，計(jì)算其中染色為陽性的細(xì)胞個數(shù)，取其平均值，比較各個擴(kuò)張時(shí)間點(diǎn)與正常皮膚組織中陽性細(xì)胞數(shù)目的差異。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 擴(kuò)張模型穩(wěn)定性的比較

A組中構(gòu)建的30只擴(kuò)張動物模型在擴(kuò)張的5周內(nèi)，無一例發(fā)生注射壺被鼠咬掉，并且短注射導(dǎo)管能夠限制擴(kuò)張囊的位置，使其不會因?yàn)槭蟮膭×疫\(yùn)動而在皮下游走，擴(kuò)張的皮膚區(qū)域更為恒定，模型構(gòu)建的成功率為100%。B組中構(gòu)建的30只擴(kuò)張動物模型，即使將長導(dǎo)管埋在皮下，由于鼠的活動性特別大，在術(shù)后前3 d，埋在皮下的長導(dǎo)管很容易延伸到切口外面而被鼠咬斷。在擴(kuò)張的第1周，有11只擴(kuò)張器的注射壺被鼠咬掉，后4周有3只注射壺被鼠咬掉。由于注射導(dǎo)管長，有4只擴(kuò)張囊因鼠的劇烈活動在皮下游走移位，模型構(gòu)建的成功率只有40%。A組模型構(gòu)建的穩(wěn)定性明顯高于B組。

2.2 HE染色結(jié)果

未擴(kuò)張的正常皮膚組織表皮層比較平整，表皮釘突短而尖，極性過度明顯。真皮層膠原纖維束大小均勻、排列整齊，未見到炎癥細(xì)胞浸潤(圖4)。擴(kuò)張后的皮膚組織表皮層明顯增厚，表皮皺褶明顯、凹凸顯著，表皮釘突變得長而鈍并深入真皮層內(nèi)，形成島狀結(jié)構(gòu)；細(xì)胞胞體變大，縱軸變長，細(xì)胞層次和數(shù)目明顯增加，排列較為緊密，基底層的變化最為顯著，極性過度不明顯。真皮層稍微變薄，膠原纖維束明顯變大，排列欠整齊，間距增寬，其間可見到有炎癥細(xì)胞浸潤(圖5)。以上這些變化，從擴(kuò)張后第1周開始出現(xiàn)，擴(kuò)張后第4周最為顯著。

2.3 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

擴(kuò)張皮膚PCNA表達(dá)情況：①在正常未擴(kuò)張皮膚組織中，只在表皮基底層觀察到PCNA陽性表達(dá)的增殖細(xì)胞，沿表皮基底層散在點(diǎn)狀分布，數(shù)目較少，真皮層尚未發(fā)現(xiàn)PCNA+細(xì)胞(圖6)。②在受到擴(kuò)張應(yīng)力刺激的皮膚組織中，PCNA+細(xì)胞的數(shù)目明顯增多，在表皮基底層和真皮的毛囊鞘周圍均可見到PCNA+細(xì)胞，PCNA+細(xì)胞呈點(diǎn)狀密集分布于表皮基底層，呈現(xiàn)復(fù)層排列，最高可達(dá)2、3層，在棘細(xì)胞層和顆粒細(xì)胞層也可見到少量點(diǎn)狀分布。在真皮層也可見到環(huán)繞毛囊鞘外周呈點(diǎn)狀分布的PCNA+細(xì)胞(圖7)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：擴(kuò)張后第3周，PCNA+細(xì)胞數(shù)目達(dá)到最高峰，數(shù)目高于其他各擴(kuò)張時(shí)間點(diǎn)。擴(kuò)張后各時(shí)間點(diǎn)皮膚組織中，陽性細(xì)胞數(shù)目顯著高于正常未擴(kuò)張皮膚組織(P<0.05)，見表1。

3 討論

自從C Radovan (1976年)發(fā)明了皮膚軟組織擴(kuò)張術(shù)，該項(xiàng)技術(shù)早已在臨床中廣泛應(yīng)用于整形外科領(lǐng)域的修復(fù)重建中，從1985年開始在我國推廣應(yīng)用已有近30年的歷史。有關(guān)皮膚軟組織擴(kuò)張術(shù)的文獻(xiàn)報(bào)道數(shù)量巨大，但主要集中于臨床應(yīng)用方面；有關(guān)基礎(chǔ)理論研究的文獻(xiàn)相對較少，基礎(chǔ)研究也主要集中在擴(kuò)張后皮膚局部組織形態(tài)與病理、生理的變化，擴(kuò)張方法改進(jìn)的研究，皮瓣預(yù)構(gòu)和延遲作用等方面的研究[3]，有關(guān)擴(kuò)張機(jī)械應(yīng)力作用下皮膚組織增生的機(jī)制仍不清楚?；A(chǔ)理論的研究必然離不開動物模型的建立，既往我們研究所已有李江、胡亞蘭、王曉燕等[3-5]用家豬為實(shí)驗(yàn)動物構(gòu)建模型；賀忠文、陳惠平等[6-7]分別用家犬和兔子為實(shí)驗(yàn)動物構(gòu)建模型，但用這些大動物構(gòu)建模型存在手術(shù)麻醉困難、術(shù)后護(hù)理不便、大批量構(gòu)建模型成本高等問題，而且能夠用于這些大動物的抗體等分子生物學(xué)試劑很有限，使得研究深度受到限制。為了避免使用大動物帶來上述存在的問題和局限因素，劉洋、李翅翅等[8-10]用鼠為實(shí)驗(yàn)動物構(gòu)建模型。但劉洋等并未詳細(xì)介紹模型的構(gòu)建方法；李翅翅等使用的是上海威寧公司生產(chǎn)的10 ml擴(kuò)張器，最初選擇背部近尾處橫行切口[9]，但在手術(shù)后的飼養(yǎng)階段發(fā)現(xiàn)，由于鼠的活動性大，身體容易屈曲，尾端外置的注射壺很容易被鼠咬掉，導(dǎo)致模型構(gòu)建的成功率相對較低。因此，李翅翅等改變切口位置，選擇近頸部橫行切口[10]，但由于威寧公司生產(chǎn)的微型擴(kuò)張器注射導(dǎo)管偏長，即使將長導(dǎo)管埋在皮下，由于鼠的活動性特別大，在術(shù)后前3 d傷口未愈合時(shí)，埋在皮下的長導(dǎo)管很容易延伸到切口外面而被鼠咬斷；就需要用懸吊等方法限制鼠的自由活動，但這樣就給術(shù)后飼養(yǎng)帶來了很大的不便，而且影響鼠的生命質(zhì)量。為了避免注射壺被鼠咬掉，同時(shí)又不限制鼠的自由活動，我們自行改良設(shè)計(jì)了短注射導(dǎo)管枕形擴(kuò)張器(20 ml)，選擇近頸部橫行切口，主要有以下優(yōu)點(diǎn)：①改良設(shè)計(jì)的擴(kuò)張器注射導(dǎo)管長度只有1.5 cm，手術(shù)時(shí)將注射壺打結(jié)固定于頸部，沒有多余長度的導(dǎo)管可以從皮下延伸出來，因此注射壺不容易被鼠咬掉；②注射壺固定于頸部不易被鼠咬掉，因此，無需限制鼠的自由活動，可減少對鼠生命質(zhì)量的影響，而且術(shù)后護(hù)理、飼養(yǎng)更方便；③注射導(dǎo)管較短可以限制擴(kuò)張囊在鼠皮下的游走，使皮膚擴(kuò)張的位置不會因?yàn)槭蟮幕顒有源蠖l(fā)生改變；④枕形擴(kuò)張囊的設(shè)計(jì)比起圓形擴(kuò)張囊可以使擴(kuò)張位置更恒定，也限制了擴(kuò)張囊因鼠的活動劇烈而游走，并且在切取擴(kuò)張皮膚作標(biāo)本時(shí)，擴(kuò)張中心位置更容易標(biāo)記和選擇。

圖4 正常未擴(kuò)張皮膚(HE ×100)圖5 擴(kuò)張后第4周皮膚(HE ×100)圖6 正常未擴(kuò)張皮膚(PCNA ×200)圖7 擴(kuò)張后第3周皮膚(PCNA ×200)

Fig4 Unexpanded skin (HE ×100).Fig5 Expanded skin at 4 weeks (HE ×100).Fig6 Unexpanded skin (PCNA ×200).Fig7 Expanded skin at 3 weeks (PCNA ×200).

表1 正常未擴(kuò)張和擴(kuò)張后各時(shí)間點(diǎn)皮膚組織中PCNA陽性細(xì)胞數(shù)目

注：與正常未擴(kuò)張皮膚比較，*P<0.05

目前,公認(rèn)的擴(kuò)張后新增皮膚面積的來源有3種：①生物性生長[11-12]；②彈性蠕變；③周圍組織移位。其中，生物性生長是證明皮膚擴(kuò)張成功的標(biāo)志。PCNA是反應(yīng)細(xì)胞增殖的良好標(biāo)志物，實(shí)驗(yàn)通過PCNA免疫組織化學(xué)染色，證實(shí)了擴(kuò)張后的大鼠皮膚組織中PCNA的高表達(dá)，此外,HE染色的鏡下結(jié)構(gòu)也表明擴(kuò)張后的皮膚組織表皮層明顯增厚。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果與臨床上人體擴(kuò)張后皮膚組織在形態(tài)學(xué)上的變化及實(shí)驗(yàn)結(jié)論相一致[13]，證明了該擴(kuò)張模型的擴(kuò)張效果，能夠產(chǎn)生“額外”的新生皮膚。筆者詳細(xì)介紹了采用自行改良設(shè)計(jì)的短注射導(dǎo)管枕形擴(kuò)張器構(gòu)建大鼠皮膚軟組織擴(kuò)張模型的實(shí)驗(yàn)方法，并通過HE染色結(jié)果顯示的組織學(xué)變化和PCNA免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示的擴(kuò)張應(yīng)力對皮膚細(xì)胞增殖產(chǎn)生的促進(jìn)作用，證明了其擴(kuò)張效果；希望能為其他研究擴(kuò)張皮膚新生機(jī)制的研究者，提供一個良好的擴(kuò)張器材料和構(gòu)建動物模型穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)方法。

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Applicationofimprovedexpanderonconstructratmodelofskinandsofttissueexpansion

YANGDeng-feng,MAJing,SUYing-jun,etal.
(InstituteofPlasticSurgery,XijingHospital,theFourthMilitaryMedicalUniversity,Xi′an710032,China)

ObjectiveThe rat model of skin and soft tissue expansion was constructed to explore the effect of the tensile stress on the skin cell differentiation and further to detect the result of expansion which could offer the stable animal model for the newborn mechanisms of expanded skin.MethodsSD rats were randomly divided into two groups (30 rats in each group). Improved expanders were applied in group A, and ordinary expander which were produced by Shanghai Winner company were applied in group B. Both the expanders were implanted under superficial fascia on the back of SD rats. Samples of normal skin and expanded skin were collected from rats in group A. The structure of skin was observed with HE staining, and the distribution characteristics of PCNA positive cells were observed with immunohistochemistry staining.ResultsStability of the model in group A was significantly higher than that in group B. After the expansion, the epidermis obviously was thickened, and the dermis were thinned. Punctate distribution of proliferating cells was mainly observed in the basal layer of the epidermis and hair follicle sheath with immunohistochemistry staining.ConclusionIn this study, we provided a good expander material and stable experimental methods to construct an animal model of skin and soft tissue expansion.

Skin and soft tissue expansion； Animal model； Expander； Skin proliferation

10.3969/j.issn.1673-7040.2014.04.018

R332

A

1673-7040(2014)04-0241-04

2013-11-04)

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81171826;81272117);陜西省社發(fā)攻關(guān)項(xiàng)目(2012SF2-01-2)

710032 陜西 西安，第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院 全軍整形外科研究所

楊登峰(1984-)，男，安徽阜陽人，碩士研究生.

馬顯杰，710032,第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院 全軍整形外科研究所,電子信箱: majing@fmmu.edu.cn