天麻飲片分級(jí)的研究

仲瑞雪，鐘 戀，萬(wàn) 軍，周 霞*，吳純潔*

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川成都 611137;2.西南交通大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川成都 610031)

天麻為蘭科植物天麻 Gastrodia elata Bl.的干燥塊莖［1］，又名赤箭，主產(chǎn)于陜西、四川、貴州、云南等地［2］。天麻性平、味甘，歸肝經(jīng)，具有熄風(fēng)止痙、平肝潛陽(yáng)的功能［3-4］，主要用于治療頭痛、眩暈等癥［5-7］。天麻素為其主要的活性物質(zhì)，具有鎮(zhèn)痛、降壓、解痙等藥理作用［8-14］。目前僅天麻藥材有等級(jí)劃分，而飲片分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)尚不完善［15］。課題組針對(duì)目前市場(chǎng)上天麻飲片等級(jí)劃分模糊，劃分標(biāo)準(zhǔn)不完善等問題，開展天麻飲片等級(jí)的研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與儀器

1.1 材料 本研究所用藥材為蘭科植物天麻Gastrodia elata Bl.的干燥塊莖，生長(zhǎng)期為2～4年，家種，冬麻，樣品采收時(shí)間為2011年10月至2011年12月，分別購(gòu)于陜西漢中、四川綿陽(yáng)、貴州畢節(jié)，每批采樣10 kg。藥材經(jīng)西南交通大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院宋良科教授鑒定為蘭科植物天麻Gastrodia elata Bl.的干燥塊莖，并委托四川新荷花中藥飲片有限公司加工為飲片，樣品保存于西南交通大學(xué)生物工程實(shí)驗(yàn)室。天麻素對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)110807-200205)。乙腈、甲醇均為色譜純，其余試劑為分析純。

1.2 儀器 島津LC-2010A高效液相色譜儀(日本島津公司);Sartorius BP 211D電子天平(感量0.1 mg、0.01 mg;載量210 g、80 g;德國(guó)賽多利斯公司);Autoscience AS 5150A超聲波清洗器(天津奧特賽恩斯儀器有限公司);電熱式恒溫水浴鍋(江蘇金壇宏凱儀器廠)，色譜柱Global chromatography C18(250 mm×4.6 mm，5μm，蘇州環(huán)球色譜有限責(zé)任公司);實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)軟件為SPSS 17.0。

2 方法與結(jié)果

2.1 天麻飲片等級(jí)調(diào)研 課題組成員對(duì)四川綿陽(yáng)平武縣、貴州畢節(jié)大方縣、陜西漢中略陽(yáng)縣、寧強(qiáng)縣的天麻基地及產(chǎn)地中藥飲片廠進(jìn)行了調(diào)研。結(jié)果顯示，國(guó)內(nèi)天麻藥材分級(jí)仍沿用1984年的《七十六種藥材商品規(guī)格標(biāo)準(zhǔn)》按每公斤支數(shù)劃分等級(jí)，對(duì)天麻飲片的分級(jí)概念卻比較模糊，大多數(shù)飲片廠并沒有對(duì)飲片進(jìn)行分級(jí)，只有在客戶有分級(jí)要求時(shí)，才對(duì)天麻飲片進(jìn)行分級(jí)加工。

2.2 天麻飲片片型測(cè)定 課題組共采集了12批樣品。每批樣品選擇300個(gè)樣本進(jìn)行測(cè)量，測(cè)定結(jié)果見表1。

表1 天麻飲片樣品片型測(cè)定結(jié)果(n=300)Tab.1 Sheet-type measurement results of Gastrodiae Rhizoma pieces(n=300)

由表1可見，各樣品中片型大小由大到小排序，縱片S1=S2＞S3=S4＞S5=S6;橫片 S7＞S10＞S11=S12＞S8=S9。

2.3 天麻飲片水分、浸出物測(cè)定 按2010年版《中國(guó)藥典》一部附錄水分、總灰分、浸出物測(cè)定方法測(cè)定，平行測(cè)定3份，結(jié)果見表2。

表2 天麻飲片樣品水分、總灰分、浸出物測(cè)定結(jié)果(n=3)Tab.2 Moisture，total ash and extract measurement results of Gastrodiae Rhizoma pieces(n=3)

由表2可見，各樣品中含水量高低排序?yàn)镾8＞S12＞S2＞S7＞S1=S3＞S11＞S4＞S10＞S5＞S6＞S9，總灰分高低排序?yàn)镾5=S10＞S6=S11=S12＞S2＞S3=S7=S9＞S4=S8＞S1，75%乙醇浸出物高低排序?yàn)镾3=S9＞S4=S5=S6＞S8＞S7＞S2＞S1＞S11＞S12＞S10。

2.4 天麻飲片中天麻素測(cè)定［1］

2.4.1 色譜條件 Global chromatography C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5μm);流動(dòng)相為乙腈-0.05%磷酸水溶液(3∶97);體積流量1.0 mL/min;柱溫25℃;檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm;進(jìn)樣量5μL。理論板數(shù)按天麻素峰計(jì)算應(yīng)不低于5000。

2.4.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取在80℃減壓干燥1 h的天麻素對(duì)照品適量，精密稱定，加流動(dòng)相制成每1 mL含50μg的溶液，即得。

2.4.3 供試品溶液制備 取本品粉末(過三號(hào)篩)約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入稀乙醇50 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流3 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用稀乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液10 mL，濃縮至近干，殘?jiān)右译?水(3∶97)混合溶液溶解，轉(zhuǎn)移至25 mL量瓶中。用乙腈-水(3∶97)混合溶液稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4.4 線性關(guān)系 精密稱取天麻素對(duì)照品50 mg，置100 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液;再分別精密吸取對(duì)照品溶液1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL，置25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液。按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。以峰面積為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?；貧w方程Y=1.49×106X+28847.64，r=0.9999，天麻素進(jìn)樣量在0.2～2.0μg范圍內(nèi)與峰面積呈線性關(guān)系。

2.4.5 樣品測(cè)定 分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品(樣品1～12)溶液各5μL，注入液相色譜儀，結(jié)果見圖1，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，按干燥品計(jì)算，結(jié)果見表3。

由表3可見，各樣品中天麻素含有量高低為S4＞S3＞S6=S5＞S2＞S1＞S7＞S9＞S8＞S12＞S11＞S10。

2.5 天麻飲片指紋圖譜研究［16-20］

2.5.1 供試品溶液制備 取本品粉末(過三號(hào)篩)約4 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流1 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

圖1 天麻素對(duì)照品(A)及12批天麻飲片(B)的HPLC圖譜Fig.1 HPLC chromatograms of Gastrodiae Rhizoma pieces for reference(A)and twelve samples(B)

表3 天麻飲片樣品中天麻素測(cè)定結(jié)果(n=3)Tab.3 Gastrodin assay results of Gastrodiae Rhizoma pieces(n=3)

2.5.2 參照物溶液的制備 取天麻素對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含100μg的溶液，即得。

2.5.3 色譜條件 Global chromatography C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5μm);以0.4%磷酸水溶液為流動(dòng)相A，乙腈為流動(dòng)相B，按表4中的規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫;體積流量為1 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)為270 nm;柱溫25℃;進(jìn)樣量10μL。

2.5.4 方法學(xué)考察

2.5.4.1 精密度試驗(yàn) 取同一批天麻樣品，按上述供試品溶液制備方法和色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，連續(xù)進(jìn)樣6次，以天麻素峰(4號(hào)峰)作為參照峰，指紋圖譜中各特征峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD分別在0.38%～1.03%和0.41% ～2.92%，均小于3%，表明儀器精密度良好。

表4 梯度條件Tab.4 Gradient conditions

2.5.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批天麻樣品，按上述供試品溶液制備方法和色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，分別在0、2、4、6、8、12 h不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，以天麻素峰(4號(hào)峰)作為參照峰，指紋圖譜中各特征峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD分別在0.38%～1.45%和0.79% ～2.88%，表明樣品在12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.5.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一天麻樣品6份，按上述供試品溶液制備方法和色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，以天麻素峰(4號(hào)峰)作為參照峰，指紋圖譜中各特征峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD分別在0.20%～0.66%和1.46% ～2.86%。表明本方法重復(fù)性良好。

2.5.5 對(duì)照指紋圖譜的建立及共有峰的確定 將12批天麻樣品，按“2.5.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按以上色譜條件測(cè)定。采用國(guó)家藥典委員會(huì)中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件(2004A版)，以中位數(shù)生成指紋圖譜共有模式，共確定11個(gè)共有峰，結(jié)果見圖2、3。

圖2 天麻飲片指紋圖譜共有模式圖Fig.2 Common fingerprints mode of Gastrodiae Rhizoma pieces

圖3 12批天麻飲片指紋圖譜疊加圖Fig.3 HPLC fingerprints of 12 batches of Gastrodiae Rhizoma pieces

2.5.6 共有指紋峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積在所建立的色譜條件下，天麻各樣品的特征峰均有較好的分離，保留時(shí)間較為穩(wěn)定，同時(shí)11個(gè)特征峰均能穩(wěn)定出現(xiàn)，以天麻素(4號(hào)峰)為S峰，計(jì)算特征峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，結(jié)果見表5、6。

2.5.7 相似度分析 采用《國(guó)家藥典》委員會(huì)中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件(2004A

版)，以生成的指紋圖譜共有模式為對(duì)照計(jì)算各批次樣品的相似度，結(jié)果見表7。

表5 12批天麻飲片指紋圖譜的相對(duì)峰面積Tab.5 Relative peak areas of 12 batches of Gastrodiae Rhizoma pieces fingerprint

表6 12批天麻飲片指紋圖譜的相對(duì)保留時(shí)間Tab.6 Relative retention time of 12 batches of Gastrodiae Rhizoma pieces fingerprint

表7 12批天麻飲片指紋圖譜的相似度Tab.7 Sample similarity calculation results of 12 batches of Gastrodiae Rhizoma pieces

由表7可知，按樣品相似度可將樣品分三類，S3～S6為Ⅰ類，相似度在0.93以上，S1～S2為Ⅱ類，相似度在0.91至0.93之間，其余為Ⅲ類，相似度在0.7以下。

2.5.8 聚類分析 以各樣品共有峰的相對(duì)峰面積值為變量，利用SPSS 17.0聚類分析法，采用組間距離法，歐氏距離平方作為測(cè)度，對(duì)12批樣品進(jìn)行分類，結(jié)果見圖4。

圖4 12批天麻指紋圖譜聚類分析Tab.4 Cluster analysis of 34 batches of 12 batches of Gastrodiae Rhizoma pieces

由上圖可以得出，聚類分析結(jié)果大致將樣品分為三類，S3～S6為Ⅰ類，S1～S2為Ⅱ類，其余樣品為Ⅲ類。根據(jù)指紋圖譜相似度分析和聚類分析，聚類趨勢(shì)與相似度計(jì)算結(jié)果基本一致，兩種方法的結(jié)果得到了相互驗(yàn)證。

3 結(jié)果

3.1 現(xiàn)有分類法的矛盾 本研究中12個(gè)樣品按片型大小排序，最大為S1、S2、S7，最小為S8、S9;按水分含有量高低排序，最高為S8，最低為S9;按總灰分含有量高低排序，最高為S5、S10，最低為S1;按浸出物含有量高低排序，最高為S3、S9，最低為S10;按天麻素含有量高低排序，最高為S4，最低為S10。經(jīng)調(diào)研，現(xiàn)有天麻飲片分級(jí)方法單純采用片型大小來劃分，可能會(huì)出現(xiàn)較大片型直接被劃分為市場(chǎng)一級(jí)飲片而其水分、總灰分、浸出物、天麻素含有量并不是最優(yōu)，如S1、S2、S10市場(chǎng)等級(jí)都是一級(jí)，水分含有量分別為11.2%、11.4%、10.8%，總灰分含有量分別為2.3%、2.6%、2.8%，浸出物含有量分別為 16.7%、16.9%、13.9%，天麻素含有量分別為0.71%、0.73%、0.22%，均不是最優(yōu)。因此，如只按飲片大小劃分等級(jí)，可能會(huì)出現(xiàn)外在質(zhì)量與內(nèi)在質(zhì)量不統(tǒng)一的矛盾。目前，天麻飲片分級(jí)還沒有統(tǒng)一的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。

3.2 “三步分級(jí)法”劃分天麻飲片等級(jí) 為解決上述矛盾，同時(shí)結(jié)合市場(chǎng)實(shí)際情況，課題組創(chuàng)新采用“三步分級(jí)法”(以下簡(jiǎn)稱“三步法”)確定飲片標(biāo)準(zhǔn)，即“一步定統(tǒng)貨、二步定一級(jí)、三步定優(yōu)級(jí)”，結(jié)合天麻飲片具體分級(jí)方法如下。

3.2.1 第一步 按照藥典方法對(duì)樣品進(jìn)行檢查，符合藥典標(biāo)準(zhǔn)的樣品均劃為統(tǒng)貨。實(shí)驗(yàn)共收集12個(gè)樣品，均檢驗(yàn)合格，暫定為統(tǒng)貨。

3.2.2 第二步 采用傳統(tǒng)分級(jí)方法，即根據(jù)天麻飲片長(zhǎng)徑進(jìn)行選優(yōu)，分出統(tǒng)貨和一級(jí)及以上。實(shí)驗(yàn)共收集12個(gè)樣品，結(jié)合市售天麻飲片實(shí)際情況，2個(gè)樣品劃為統(tǒng)貨，其余10個(gè)樣品定為一級(jí)及以上。

3.2.3 第三步 在傳統(tǒng)分級(jí)方法的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步考察天麻素含有量、75%乙醇浸出物量、指紋圖譜聚類分析及相似度等內(nèi)在指標(biāo)，從10個(gè)樣品選優(yōu)，共篩選出優(yōu)級(jí)樣品4個(gè)，其余6個(gè)樣品定為一級(jí)。

3.3 統(tǒng)計(jì)方法對(duì)飲片等級(jí)的驗(yàn)證 運(yùn)用SPSS 17.0軟件對(duì)“三步法”分出的不同等級(jí)的天麻飲片作Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)，結(jié)果顯示，水分P=0.313，P＞0.05，總灰分的P=0.485，P＞0.05，可認(rèn)為統(tǒng)貨、一級(jí)和優(yōu)級(jí)的水分、總灰分含有量沒有差異，不能作為分級(jí)指標(biāo)。75%浸出物的P=0.014，P＜0.05，天麻素含有量的P=0.023，P＜0.05，指紋圖譜相似度結(jié)果P=0.011，P＜0.05，指紋圖譜聚類分析結(jié)果一級(jí)和優(yōu)級(jí)天麻有差異，可認(rèn)為一級(jí)和優(yōu)級(jí)的75%乙醇浸出物含有量、天麻素含有量、指紋圖譜有差異，可作為分級(jí)指標(biāo)。

統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，采用“三步法”對(duì)天麻飲片分等級(jí)可行，具有可操作性及實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

4 結(jié)論

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果及“三步法”劃分等級(jí)，12批市售天麻飲片，S8，S9劃分為統(tǒng)貨，S1，S2，S7、S10、S11、S12劃分為一級(jí)，S3～S6劃分為優(yōu)級(jí)。分級(jí)流程見圖5。

5 討論

本研究結(jié)果表明，市場(chǎng)上只按天麻飲片大小分級(jí)的方法可能欠妥，課題組提出采用“三步法”劃分飲片等級(jí)，該方法兼顧了飲片的外在質(zhì)量和內(nèi)在質(zhì)量，為飲片分級(jí)提供了一種新方法。按“三步法”劃分的優(yōu)級(jí)天麻飲片均來自于道地產(chǎn)區(qū)(陜西漢中)，說明“三步法”在區(qū)分道地性方面有一定適用性。但影響道地性的因素較多，例如栽培環(huán)境、采收加工等，因此“三步法”在區(qū)分道地性方面是否具有普適性，還需擴(kuò)大樣本進(jìn)一步考察。本實(shí)驗(yàn)所述“三步法”包括的檢查項(xiàng)目有限，在此基礎(chǔ)上還可增加薄層色譜鑒別、多糖含有量等指標(biāo)進(jìn)一步完善分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，該方法對(duì)市場(chǎng)天麻飲片分級(jí)具有一定的參考意義。下一步還應(yīng)擴(kuò)大飲片種類及樣本量，進(jìn)一步驗(yàn)證“三步法”的可行性。

圖5 天麻飲片分級(jí)流程圖Tab.5 Classification flow chart of Gastrodiae Rhizoma pieces

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